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小白的PCR历程

作者 莫落
来源: 小木虫 2150 43 举报帖子
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PCR能快速扩增任何已知的基因或DNA片段,并能轻易的从只有pg水平起始DNA混合物中将目的基因扩增到ng、μg甚至mg水平。这对于分子生物领域影响是非常巨大的,可以说任何与DNA、RNA相关的地方,都有PCR技术作为支撑;任何一个分子生物学实验室,都至少有一台PCR仪。

PCR技术作为目前人类获得目的基因最常用的技术之一,其基本原理并不复杂:主要包括模板的高温变性,双链接璇分离;降温反应混合物种的特异性引物与单链DNA的特异性结合;72℃下条件下,DNA聚合酶根据模板信息诱导引物由5’-3’端延伸。

1.     PCR的基本应用:扩增目的基因
老老实实提取模板,设计引物加入酶切位点,利用酶切酶连构建克隆。作为分子克隆的入门基础,这里不再赘述。

2.     PCR的扩展应用:

利用PCR的原理进行点突变:

图2 PCR介导的点突变原理
做蛋白表达的同学用到点突变的时候特别多,例如利用点突变把稀缺密码子变成常用密码子,定点突变某个氨基酸等,这时就可以用到PCR:分别设计两对引物(P1-P2;P3-P4),P2和P3有20bp左右的重叠区域,在其中可以设计引入点突变,如图2所示,分别用P1-P2,P3-P4扩增出两个条带,分别回收后再按摩尔比加到一起。

    现在随着生物技术的飞速发展,很多新产品也随之出现,极大便利了土豪课题组的的科学研究;比如现在出现的点突变试剂盒,直接设计引物在要突变的地方,利用PCR进行环P,然后用Dpn I把模版消化进行转化就可以了,具体可以参考(site-directed mutagenesis):
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