求助连接反应中的问题，谢谢!
大家好，连接反应中遇到了问题，希望大家给予帮助，谢谢！
最近一直在构建重组质粒载体，载体为PET28a，目的片段大约为500bp。因为我是在重复师长的实验，师长使用的连接条件是：NEB连接酶，22度，10min。因为我们没有定NEB连接酶，因此在开始时，我使用的连接条件是Takara T4连接酶，22度，10min。后来发现连不上，便将条件调节为16度，3个小时。可是转化涂板后发现依然没有单克隆生长。凝胶显示酶切也正常，回收片段的浓度也测定了，根据载体与目的片段1:10进行连接，可是，就是长不出单克隆。
另外，想请问：加连接体系时时需要是冰浴条件下吗？是否是在里阿杰反应中有一些该注意的细节没有注意呢？
我实在是找不出自己是哪里出现问题了，希望大家给予帮助。谢谢了！
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坛子里相似的问题很多。。。你可以搜搜相关的帖子，看看有没有和你问题一样的。。。
当没有问题的时候，怎么做都行，
一旦有问题了，就郁闷了
建议你做实验的时候，把对照做全了，然后才好分析哪一步出了问题
具体请参看，http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3105782&authorid=426591
我用宝生物的T4连接酶，16度连接过夜没有问题。肯定能连上
谢谢大家的帮助。
额，这算小问题哈。
第一，看你的pcr产物是平末端还是粘末端。这个问题很小，但是出问题的很多。
第二，TAKARA酶就行了。NEB太贵了。TAKARA要是不放心，就4℃过夜，或者16度5个小时。我一般都是晚上做连接，4℃过夜。没出过事情。
第三，连接量按TAKARA说明书上写的计算下。
一般要是你条带亮度正好，就按5ul来问题不大的，
以前做过现在都忘记了哈哈
呵呵，takara的16度连个两小时也差不多的，你换换载体试试。另外你那个连接片段是PCR出来的还是从其他质粒上切下来的？前者的话PCR产物直接酶切有时候没有切开也看不出来的。
再有就是你的感受态效率太低也有可能。