做了将2个月的WB，从第一次做我的所有条带都已经可以做出来了，而且每次的内参条带都不齐，目的蛋白也是看不出药效，不管是按BCA测蛋白浓度，还是按内参的灰度调整上样，或者是按照统一标准进行收样（六孔板细胞接种量一致，生长时间一致，收样时裂解细胞一致，加裂解液一样），我拿同一份样品，抛出来的内参和目的蛋白都不齐，趋势都不一样，请大侠指教！
1.上样前样品1000rpm/min，离心1min，取上清，每孔上样20ul，。
2，跑胶80v，跑过浓缩胶。换成100v跑至胶底上1cm。
3.转膜300mA，1,5h。
4.转膜结束TBST洗膜3次，5min每次，5%脱脂奶粉封闭1h，然后TBST洗去膜上多余的封闭液。抗体使用的是abcam公司的。
5.一抗均按1:10000稀释，附一抗4度过夜，
6.一抗孵育后，TBST洗膜3次，5min每次，同样方法附二抗。室温1小时
7.二抗孵育后，TBST洗3次，每次5min，TBS最后洗一遍。
8，配好ECL发光液，机器发光。
请教各位战友我的反应体系是否有问题，或者有别的原因影响我的内参如此不齐？

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