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pinkzou

新虫 (初入文坛)

[求助] 想用biobrick（生物砖）快速构建多拷贝，但构不出来 已有1人参与

我先在载体的目的基因的表达框上游加入了EcoR1、Xbal1位点，在下游加入了Spe1和Pst1位点，然后构建了与含目的基因载体不同抗性的含EcoR1、Xbal1、Spe1和Pst1的空载体，选用biobrick的原因是不能做胶回收，因为目的基因与载体的其他部分片段大小相似，做不了胶回收，然后又想快速构建多拷贝质粒。。。。。但是尝试了很多次，无法用biobrick构建。以下是我的具体步骤，请大佬们看看我做的是不是有问题。首先用PCR扩增与目的基因载体不同抗性的载体将其称为B（含目的基因的载体称为A）然后将B的PCR产物做胶回收，然后用EcoE1和Pst1对胶回收产物酶切，用EcoR1和Spe1对A酶切，同时再配一个体系用Xbal1和Pst1对A酶切，然后再将三个酶切产物进行连接转化，但是始终不能得到目的菌株。A载体和B载体如图所示。新人，没啥金币，实在对不住啊

想用biobrick（生物砖）快速构建多拷贝，但构不出来
A


想用biobrick（生物砖）快速构建多拷贝，但构不出来-1
B
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1楼 2021-07-30 15:47:20
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lixinlihu

金虫 (正式写手)
感觉描述的有问题。不知道为何不用如今成熟的一步克隆或者golden gate。

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2楼2021-07-31 20:10:16
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pinkzou

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lixinlihu at 2021-07-31 20:10:16
感觉描述的有问题。不知道为何不用如今成熟的一步克隆或者golden gate。

因为biobrick不用多次胶回收且不用考虑PCR引入的突变，同时可以快速构建多拷贝
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3楼2021-09-23 13:27:10
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hemary

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pinkzou at 2021-09-23 13:27:10
因为biobrick不用多次胶回收且不用考虑PCR引入的突变，同时可以快速构建多拷贝...

求指导 为什么不用考虑PCR引入的突变？
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4楼2022-05-13 13:13:16
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啊哈哈i

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by hemary at 2022-05-13 13:13:16
求指导 为什么不用考虑PCR引入的突变？...

因为他的目的基因是酶切的，不是PCR扩增的

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5楼2022-07-22 10:25:22
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啊哈哈i

新虫 (小有名气)
请教一下，我觉得你这样只能得到一个单拷贝的载体，用Xbal1和Pst1酶切的片段是怎么连上呢载体的呢？

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6楼2022-07-22 10:27:37
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