[求助] 想用biobrick（生物砖）快速构建多拷贝，但构不出来 已有1人参与

我先在载体的目的基因的表达框上游加入了EcoR1、Xbal1位点，在下游加入了Spe1和Pst1位点，然后构建了与含目的基因载体不同抗性的含EcoR1、Xbal1、Spe1和Pst1的空载体，选用biobrick的原因是不能做胶回收，因为目的基因与载体的其他部分片段大小相似，做不了胶回收，然后又想快速构建多拷贝质粒。。。。。但是尝试了很多次，无法用biobrick构建。以下是我的具体步骤，请大佬们看看我做的是不是有问题。首先用PCR扩增与目的基因载体不同抗性的载体将其称为B（含目的基因的载体称为A）然后将B的PCR产物做胶回收，然后用EcoE1和Pst1对胶回收产物酶切，用EcoR1和Spe1对A酶切，同时再配一个体系用Xbal1和Pst1对A酶切，然后再将三个酶切产物进行连接转化，但是始终不能得到目的菌株。A载体和B载体如图所示。新人，没啥金币，实在对不住啊 A B

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