请问两次是否连续进样，或是同一个体系下进样的？
如果是不同天进样的问题不大；
如果连续两次进样的话，有可能是色谱柱没有平衡好造成的，或是样品对流动性体系有影响（pH等），

冲柱子后有没有跑基线，基线跑平后再进样

第二针平衡了吧

最有可能的是流动相比例出了问题

个人认为如果是同一天连续进样的话，可能是因为柱子没有平衡好，以及柱温不稳定也可能造成保留时间的漂移。你可以考虑上述因素看看

你应该在同一条件下进第三针样品，甚至第四针，这样便于分析