小鼠抗体重链的引物无法扩增出目的基因,急求解决方案
从文献中找的小鼠抗体重链的引物3条,找生工进行合成。Taq聚合酶是Takara的普通的,不是高保真的。
轻链一次就扩增出目的基因,重链一直扩增不出来。尝试了好多退火温度(55.58.60.62 结果如图.),延伸温度72,延伸时间42s和1min20s,循环数在30和35,电泳显示二聚体很多。
变性94℃30s,退火不同温度都是30s,延伸72℃有42s有1min20s的,循环30次的和35次的
现在怀疑是不是引物有问题,因为不是自己设计的,硕士论文中的重复性应该不高。
用cDNA模板跑内参引物,效果很好,条带很清晰很亮,模板应该没有问题。
看电泳图有些能隐约看到700bp处出来了条带,但是都不是很明显。
重链5‘Tm值61.56,GC为59.09;
重链3’第一条引物 Tm值62.70,GC为46.67
重链3’第二条引物 Tm值65.35,GC为59.26
重链3’第三条引物 Tm值63.07,GC为53.33
真的不知道该怎么办了。求大神支招啊,建议怎么设计反应条件!!!不胜感激
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4.jpg@youlinglyw@wizardfan 返回小木虫查看更多
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建议楼主做个梯度吧,Tm最低设定50℃,另外有可能是引物浓度高。。。
你的样品取自什么组织和细胞,引物是针对哪部分啊?
换引物吧,以前扩过人的抗体轻重链,扩不出来的一般都是引物的问题
放假前最后一次实验最出来了,还是94℃变性30s,退火59℃30s,延伸72℃增加到一分半,引物浓度变成1uM,上下游各加1ul。电泳结果还是挺好的!证明引物没问题
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