重叠延伸PCR引物合成求助
最近想把两个DNA片段连起来，想用SOE PCR的方法，看了半天引物设计时都没有搞明白。
假设我的片段A序列为：5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CAC CAT3’
B片段的序列为：5’GACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’
希望的结果为A在前B在后：
5’CGA GGATCCAG CATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG ........ ACT GGT GACCAT CAT CAC CAT CACCATGACGATGACGACAAGccagtaccccc................agggctcttcggcaaatgtaaGTCGACCAGG3’
中间两条引物该怎样设计呢？谢谢
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京公网安备 11010802022153号
引物的设计不是有软件吗？我的实验也需要设计引物，师姐推荐我用primer premier5这个软件，因为我的目的基因还没确定，所以这个软件我还没用过，不知好不好用呵呵。。。
这个我知道，呵呵。连接片段稍微麻烦点
，
取A序列的末端20个和B序列的前端20个，分别与A和B进行PCR，再回收产物做模板进行第二次PCR。我只是举个例子，具体的引物你还得仔细分析一下。
就是搭桥PCR。设计引物时A片段3‘端取20bp左右的碱基，B片段5’端取20个碱基左右，总碱基不要超过50bp（大于50公司合成会比较贵），同时合成该引物反向互补片段。
用这条引物跟B片段的反向引物扩增B片段。再用这条引物反向互补序列为反向引物与A片段的正向引物扩增A片段。
把上一步扩增的A，B产物等摩尔混合再用A片段的正向引物与B片段的反向引物扩增，跑胶，回收你需要的大小的片段。
就是说A片段的下游与B片段的上游交接处重叠30-40个碱基就行了。A片段的下游引物稍微再往B方向延伸一些，而B片段的上游引物往A方向延伸些，他们就能重复出一段重叠区域。
1.设计2对引物，A5‘ &3’ ；B5‘&3’；A3‘和B5’ 引物有大于15bp的overlap。
2. 分别扩增A和B；
3.A和BPCR 产物等摩尔比混合，共同做模板，用A5‘和B3’扩增。
4.如果扩增效果不好，可以将A5‘和B3’ 向中间移动20左右bp重新设计引物扩增。
可以查看Overlap extension PCR
有需要的话可以把具体序列发过来，给你设计 了试试哦