pMG36e 构建的奇怪现象
质粒构建在我们实验室已是常规操作，但是最近构建pMG36e时出现一个奇怪的问题：
转化后，在红霉素（200ug/ml）筛选LB培养基上，要么没有菌落，要么长出的菌落扩大后提不出质粒。（菌体抗药性突变？也太频繁了吧？几十个克隆都这样） 请各位帮忙分析下原因。
目的基因长度：1000~2000bp（几个基因）此载体也曾连上过300bp和2500bp的片段。
酶切位点：SacI和HindIII
感受态：全式金DH5a、自制高效感受态，已验证
质粒提取试剂盒：生工和鼎国小提试剂盒，已验证
连接酶：TaKaRa Solution I 和 T4连接酶，已验证
连接接比例：质粒:目的基因=1:4~1:10
连接时间：12~16小时
以上条件、试剂连接大肠杆菌载体（pcDNA3、pMD18-T、pTA2和pGEX4T-1）都未出现问题。
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京公网安备 11010802022153号
感谢楼主的建议，我用的也是试剂盒提取，可能是菌液量的问题，我再来试一试，很奇怪，我的就是阳性空载在大肠里就是这样不好提取，因为是从别人那里买的质粒，也不知道是不是他给我的质粒有问题，呵呵，总之，十分感谢楼主的建议！
楼主，你好！不知道你的问题现在解决没有 我现在用pMG36e也遇到奇怪现象。不知道你和各位有没有什么建议。我转化之后，整个平板长满，（就像平时抗生素失效一样），完全没有办法挑单克隆，感受态用的是大肠杆菌Origa，平板红霉素浓度为250ug/ml，红霉素配好以后，验证有效。还有我的目的片段是150-200之间，连接什么比例比较好呢
你可以设计引物做一下菌落PCR筛选，选择效率高的酶切位点连接。个人感觉1000bp以下的片段相对都好连接，可能是载体：目的基因>1:10的缘故吧。再试试。
你好，我最近在提取pMG36e空载的时候，也碰到了你这样的问题，载体也在肠杆菌DH5a内，加了抗生素可以生长，但是提取质粒电泳后看不见条带。。。这个问题已经持续一个月了，请问你后来是怎么解决这个问题的
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还有，我提质粒用的是Axypre的质粒小提试剂盒
质粒小提试剂盒提取效率还是不错的，我们一般每9ml的菌液处理后，收集到一个50ul的收集管里，可以满足酶切检测的需要，克隆则是每200ML菌液常规提取后，沉淀用小提试剂盒1个管用量的溶液处理、收集（50ul，浓度可以满足酶切后回收的要求）。
您好，请问您遇到的pMG36e从大肠杆菌中不容易提取的难题解决了吗？我现在也遇到了当时您所遇到的这个问题，还麻烦前辈赐教，谢谢。
我也出现了这个问题，楼主解决了吗？