换个菌株试试吧!!

一般来说做质粒转化的菌落是不是很大的，因为质粒本来对大肠杆菌也有一点毒性，所以用质粒的时候，最好不要超过２ul，还有在做感受态细胞的时候，悬浮时，力度不要太大，轻轻悬浮，一般做感受态细胞，按照分子克隆上的说明就ＯＫ的．

Prepare competent cell(1)
1.        Pick a single colony of E.coli cells into 4~5 l LB at 37℃ shaking 250 rpm overnight(15~16 h).(or 1:1000, E.coli : LB) for example: 5ul E.coli for 5 ml LB.
2.        100 ml +2ml overnight E.coli culture at 37℃ shaking 2 h.(about  OD=0.4)
3.        Aliquot separate culure into two 50 ml prechilled sterile polypropylene tubes and leave the tube on ice 5~10 min. centrifuge cells 7 min 3000 rpm, 4℃.
4.        Resuspend(gently) each pellet in 10 ml ice-cold 0.1M Cacl2 solution. Centrifuge 5 min at 3400 rpm(1100 g), 4℃.
5.        Resuspend each pellet in 10 ml ice-cold 0.1M Cacl2 solution. Keep resuspended cells on ice for 30 min. centrifuge 5 min at 1100 g, 4℃.
6.        Resuspend each pellet completely in 4 ml of ice-cold Cacl2 solution, Aliquot 200 ul into prechilled, sterile polypropylene tubes. Freeze immediately at 4℃(last two weeks for using). Or add glycerol at 15% final concentration, freeze immediately at -70℃(last several month for using). For example: 3 ml Cacl2-E.coli with 1 ml 50% glycerol.

影响因素很多，比如氯化钙什么的，你0.22vm微孔滤膜过滤再灭菌，一些分析纯的看着干净，其实有很多杂质的；-70度保存要加甘油的；制作过程加的氯化钙要预冷的，就是尽量提供最好的条件

氯化钙可以直接灭菌！
做感受态要注意3点：
1、一定不能过了0.5，宁少不要多于0.5！
2、动作一定要快
3、时刻保持在冰上，保持低温！

我做过很多次感受态细胞了，可以说有一些心得。
基本上过程很简单：
1、从-80冰箱取出菌种，用接种环三区划线涂板，37度培养。
2、从培养了12-16个小时的平板上挑取单菌落，要分散比较好的单克隆，加0.5-1ml LB 37度摇菌6-8小时（也可12-16小时过夜摇）。
3、将小量的菌液转入大500ml三角烧瓶扩增培养。为保证通气良好，500ml三角烧瓶最多摇150ml菌液（100ml足以）。
4、扩增培养时注意将温度设为30度，稍低的温度有利于控制生长状态，不会摇过。
5、培养2小时之后测其OD值，接近0.3以后每20min测一次，在OD值达到0.3以后即可停止培养（可以用水作参比，LB培养基与水的OD值相差无几）。
6、在扩增培养同时制备0.1M CaCl2溶液。（1M CaCl2的母液用0.22um滤膜过滤后作为储存液，用时用灭菌水稀释十倍使用）
7、培养好的菌液立即置于冰上，旋转三角瓶，使其温度迅速冷却到0度。保持旋转状态10min。
8、4000rpm 4度 离心10min，弃去上清，加入0.1M CaCl2溶液。每50ml菌液加入20mlCaCl2溶液，冰上震荡重悬。
9、4000rpm 4度 离心10min，弃去上清，加入0.1M CaCl2溶液。每50ml菌液加入2 mlCaCl2溶液，冰上震荡重悬。
10、加入1/10体积的灭菌甘油。混匀后分装。

要注意的问题：
1、菌种要好，无污染。
2、所用的烧瓶、离心管应在使用前数天用去离子水充分浸泡，去除残留的各种离子。
3、扩增培养摇菌不能摇过。

好的感受态细胞对于分子实验非常重要，请牢记细节决定成败。祝你好运，

补充一句，按照这个protocal做的感受态转化效率可以达到每20ng连接产物1000个克隆。如果是阳性转化的话应该能达到每ug 1，000，000个克隆。