想用蛋白酶K除蛋白质，但不知道其使用方法，实验室也没有说明书，请教用过的前辈指点一下 返回小木虫查看更多
可以查查动物组织的DNA提取实验.
DNA 的提取 酚－氯仿提取法 取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。 将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。 将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。 取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。 上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。 将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。 勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul 1x TE中。 加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。 加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。 取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。 取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。 轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。 依所提DNA量加入20-50ul的1x TE溶解DNA。 测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。 样品在4℃下保存备用。 附: 提DNA 所用试剂配方： 1. 1M Tris.Cl 1L：800ml H2O中加121.1g Tris, 用HCl调pH 至8.5后定溶至1升， 灭菌。 2. 0.5M EDTA pH8 1L: 800ml H2O中加186.1g EDTANa2 2H2O，用NaOH调 pH至8.0，定溶至 1 升。 3. 20% SDS 2L: 在2L热水中缓慢加 400g SDS， 边加边搅拌，溶解后放置热地方保存。 4. 5M NaCl 1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定溶至1升， 灭菌。 5. 缓冲液“S” 配1L缓冲液“S” 100mM Tris.Cl pH8.5 1M Tris.Cl 100ml 100mM NaCl 5M NaCl 20ml 50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml 2% SDS 20% SDS 100ml H2O 680ml 6. 100x TE 1L: 800ml H2O中加121.1g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl调 pH至8.0, 定溶， 灭菌。 7. 50x TAE 1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M EDTA pH8.0和57.1ml冰醋酸，定溶。 8. 蛋白酶K溶液的配制 用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul 的蛋白酶K溶液； 或用超纯水配制成相同的浓度。 9. RNase (去DNA酶的RNA酶） 用水溶解RNase, 终浓度10mg/ml, 煮沸20分钟，缓慢冷却， 分装，-20℃下 保存。 10. 3M NaAc pH5.2 1L: 600ml H2O中加入408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸调pH至5.2， 然 后定溶1L ，灭菌，
蛋白酶K在配方8 个人以为用不用蛋白酶K的吧，要是提的蛋白太多，再过一遍酚氯仿，注意吸取中间沉淀的时候要小心，宁可多扔点，尽量吸上清，别吸沉淀
蛋白酶K (Proteinase K) #P8102S 60 mg 20 mg/ml 756.00元 概述：蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶，具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活，该酶在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。 来源：源于白色念球菌(Tritirachium album)。 应用： 用于质粒或基因组DNA的分离 RNA的分离 失活RNase, DNase以及反应中的其他酶类 反应条件：蛋白酶K在较广的缓冲液pH范围(pH 4-12.5)、温度范围（37-60℃）、盐浓度（如：3 M GuHCl）或尿素(4 M)条件下均有活性。在一些去污剂如：Tween20(5%)、Triton X-100 (1%)和SDS(1%)条件下也有活性。 比活性：30 units/mg。 分子量：28.9 kDa。 单位定义：在250 μl反应体系，37℃条件下1分钟内能分解释放相当于1 μmol酪氨酸的folin-阳性氨基酸和肽所需要的蛋白酶K的量定义为一个单位(1)。 浓度：20 mg/ml。 贮存条件：20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM CaCl2和50%甘油。贮存于-20℃。 参考文献： 1. Anson, M.L. (1939) J. Gen. Physiol. 22, 79. 蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等. 1.试剂配制 ①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0) 10mmol/LEDTA 150mmol/LNaCL 0.5%SDS 100～200ug/ml蛋白酶K. ②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中. 2.提取方法 有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等. 临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR扩增，或放-20℃保存. 蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.
谢谢各位！
如果是提取质粒，当然是不用蛋白酶K，然而如果是提取基因组，那么也许要用到。蛋白酶K很好配置，在一定的温度下incubate一段时间即可
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京公网安备 11010802022153号
可以查查动物组织的DNA提取实验.
DNA 的提取
酚－氯仿提取法
取液氮冷冻的叶片2-3片， 在液氮冷冻下迅速研磨成粉末。
将粉末放入到1.5 ml离心管中，然后加入缓冲液“S”750ul, 充分混匀。
将离心管置于65℃水浴中1-2小时，水浴过程中温和混匀几次。
取出离心管, 每管加入等体积的酚－氯仿(V/V=1:1)溶液600-700ul，混匀后离心，10000rpm, 10分钟。
上清液移入另一离心管中，加入等体积的氯仿，混匀后，10000rpm, 6分钟。
将上清液移入另一离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，静置一段时间，然后用枪头勾出DNA,并用70％乙醇冲洗2次。
勾出的DNA，真空干燥后将其溶于500ul 1x TE中。
加入3ul RNA 酶溶液，37℃保温1 小时。
加入等体积的酚-氯仿溶液, 轻轻混匀后, 10000rpm离心6分钟。
取上清液，加入等体积的氯仿，轻轻混匀后，10000rpm离心6分钟。
取上清液，入1/10体积3M醋酸钠，混匀后，加入2倍体积冷的无水乙醇（或95％乙醇）。
轻轻混匀静置一会儿后，用枪头勾出DNA, 用70％乙醇冲洗2次后，真空干燥。
依所提DNA量加入20-50ul的1x TE溶解DNA。
测定DNA 的浓度，取少量样品跑电泳, Agarose 胶的浓度为0.8%。
样品在4℃下保存备用。
附: 提DNA 所用试剂配方：
1. 1M Tris.Cl
1L：800ml H2O中加121.1g Tris, 用HCl调pH 至8.5后定溶至1升， 灭菌。
2. 0.5M EDTA pH8
1L: 800ml H2O中加186.1g EDTANa2 2H2O，用NaOH调 pH至8.0，定溶至 1 升。
3. 20% SDS
2L: 在2L热水中缓慢加 400g SDS， 边加边搅拌，溶解后放置热地方保存。
4. 5M NaCl
1L: 750ml H2O中加292.2g NaCl，溶解后定溶至1升， 灭菌。
5. 缓冲液“S” 配1L缓冲液“S”
100mM Tris.Cl pH8.5 1M Tris.Cl 100ml
100mM NaCl 5M NaCl 20ml
50mM EDTA pH8.0 0.5M EDTA 100ml
2% SDS 20% SDS 100ml
H2O 680ml
6. 100x TE
1L: 800ml H2O中加121.1g Tris, 37.2 EDTA Na2 2H2O, 用HCl调 pH至8.0, 定溶， 灭菌。
7. 50x TAE
1L: 500ml H2O中加242g Tris，溶解后加100ml 0.5M EDTA pH8.0和57.1ml冰醋酸，定溶。
8. 蛋白酶K溶液的配制
用20mMTris.Cl, pH8, 2mMCaCl2的缓冲液配制浓度为10ug/ul 的蛋白酶K溶液； 或用超纯水配制成相同的浓度。
9. RNase (去DNA酶的RNA酶）
用水溶解RNase, 终浓度10mg/ml, 煮沸20分钟，缓慢冷却， 分装，-20℃下 保存。
10. 3M NaAc pH5.2
1L: 600ml H2O中加入408.24gNaAc 3H2O , 溶解后，用冰醋酸调pH至5.2， 然 后定溶1L ，灭菌，
蛋白酶K在配方8
个人以为用不用蛋白酶K的吧，要是提的蛋白太多，再过一遍酚氯仿，注意吸取中间沉淀的时候要小心，宁可多扔点，尽量吸上清，别吸沉淀
蛋白酶K
(Proteinase K)
#P8102S 60 mg 20 mg/ml 756.00元
概述：蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶，具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活，该酶在较广的pH范围内(pH 4-12.5)均有活性。
来源：源于白色念球菌(Tritirachium album)。
应用：
用于质粒或基因组DNA的分离
RNA的分离
失活RNase, DNase以及反应中的其他酶类
反应条件：蛋白酶K在较广的缓冲液pH范围(pH 4-12.5)、温度范围（37-60℃）、盐浓度（如：3 M GuHCl）或尿素(4 M)条件下均有活性。在一些去污剂如：Tween20(5%)、Triton X-100 (1%)和SDS(1%)条件下也有活性。
比活性：30 units/mg。
分子量：28.9 kDa。
单位定义：在250 μl反应体系，37℃条件下1分钟内能分解释放相当于1 μmol酪氨酸的folin-阳性氨基酸和肽所需要的蛋白酶K的量定义为一个单位(1)。
浓度：20 mg/ml。
贮存条件：20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1 mM CaCl2和50%甘油。贮存于-20℃。
参考文献：
1. Anson, M.L. (1939) J. Gen. Physiol. 22, 79.
蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组 织细胞(包括石蜡包埋组织)绒毛、毛发、精斑、血液(血清、血浆、全血)局部分泌 物、尿，粪便等.
1.试剂配制
①蛋白酶K消化液:10mmol/L Tris.cl(PH8.0)
10mmol/LEDTA
150mmol/LNaCL
0.5%SDS
100～200ug/ml蛋白酶K.
②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml，临用时加入消化液中.
2.提取方法
有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组 织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.
临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50～100ul.混匀，55℃1～3小时， 或37℃过夜.加等体积的饱和酚抽提1～2次，再加等体积的氯仿:异戊醇(49:1)抽提一 次，上清加入1/10体积的pH值5.23mmol/L醋酸钠缓冲液，加入2.5倍体积的冰冷无水 乙醇(或加等体积的异丙醇)-20℃放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸 弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1～2次，特别小心的 吸弃或倒掉上清，真空或37℃温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3～8ul 用于PCR扩增，或放-20℃保存.
蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理 后，吸取上清经95～97℃或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增. 如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除 彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.
谢谢各位！
如果是提取质粒，当然是不用蛋白酶K，然而如果是提取基因组，那么也许要用到。蛋白酶K很好配置，在一定的温度下incubate一段时间即可