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为何小样诱导有条带,大量诱导后目的条带几乎没了?

如图1是预诱导时的图,使用的载体是PET-32a,目的蛋白大小约66.2kDa。小样预诱导时,由于实验室内的小型超声波破碎仪坏了,跑的胶是全菌(未破碎),条带显示有我的目的条带,小样诱导的条件是:先摇菌2.5h-3h后,加IPTG 16° 诱导20h。
然后再大量摇菌,每瓶300ml,IPTG浓度取0.3M,摇菌4h后,加IPTG 16°诱导20h后用大型低温高压破碎仪破碎,破碎后发现有白色的乳状物体??(如图2)然后离心取上清液过镍柱,用不同浓度咪唑洗脱。
可是跑胶发现我的目的蛋白浓度很低,甚至不如杂蛋白浓度。尤其是第一个孔那里的上清液中的目的蛋白浓度很低,(如图3)求助大神,为何小样诱导时条带很亮,而大量诱导反而浓度低了?是我大量诱导的条件需要改变还是蛋白在沉淀中表达?如果在沉淀中表达的话,如何才能纯化出来呢?谢谢!!
为何小样诱导有条带,大量诱导后目的条带几乎没了?
1.蛋白小样预诱导(没破碎,跑的全菌)
为何小样诱导有条带,大量诱导后目的条带几乎没了?-1
2.蛋白大量破碎后有白色乳状沉淀
为何小样诱导有条带,大量诱导后目的条带几乎没了?-2
3.大量诱导后过柱图,上清液中目的蛋白量少

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用户评论

跑一下沉淀吗,可能大部分都是包涵体的

2楼: Originally posted by xhw2033696 at 2017-06-16 10:14:15
跑一下沉淀吗,可能大部分都是包涵体的
沉淀如何跑?用什么溶解

直接加上样缓冲液跑就可以呀

4楼: Originally posted by xhw2033696 at 2017-06-16 10:35:40
直接加上样缓冲液跑就可以呀
取多少沉淀啊?不应该让他溶解悬浮吗,

取少量沉淀后加20倍重量的8M尿素溶解,再跑胶。

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