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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切之后跑胶，条带很暗，回收之后就什么都没有了
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panyax

新虫 (初入文坛)

[求助] 酶切之后跑胶，条带很暗，回收之后就什么都没有了 已有2人参与

我的片段大概700bp左右，我连了T载之后，再进行双酶切。酶切之后，进行电泳，条带很暗，切胶回收再跑胶，就没有条带了，请问有什么解决办法啊
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1楼 2015-12-23 10:17:00
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草溪河

铁虫 (著名写手)
首先回收的条带本身就暗，再者回收过程的损失也是很大的，其次再跑胶不可能把全部回收溶液上样吧，所以最后你胶上的实际DNA样量有多少就可想而知了

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2楼2015-12-23 10:29:56
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草溪河

铁虫 (著名写手)
要么回收时多回收几个条带，增加目的片段的量；要么考虑酶切回收后直接进行后续试验

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3楼2015-12-23 10:31:43
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-12-23 10:31:43
要么回收时多回收几个条带，增加目的片段的量；要么考虑酶切回收后直接进行后续试验

这是我酶切之后跑的回收胶电泳图，第一个泳道是maker，2,3,4泳道是同一个样品，我把它们做一管回收的；5，6泳道是一个样品，我也是做一管回收的。这种情况，我是不是只能尝试下酶切胶回收之后，直接连表达载体试试看，因为做了几次都是这种情况
酶切之后跑胶，条带很暗，回收之后就什么都没有了
胶回收.jpg
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4楼2015-12-23 10:52:41
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 草溪河 at 2015-12-23 10:31:43
要么回收时多回收几个条带，增加目的片段的量；要么考虑酶切回收后直接进行后续试验

maker从上往下，依次是1500bp,1000bp，900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp,100bp
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5楼2015-12-23 10:57:31
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草溪河

铁虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by panyax at 2015-12-23 10:52:41
这是我酶切之后跑的回收胶电泳图，第一个泳道是maker，2,3,4泳道是同一个样品，我把它们做一管回收的；5，6泳道是一个样品，我也是做一管回收的。这种情况，我是不是只能尝试下酶切胶回收之后，直接连表达载体试试 ...

可以

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6楼2015-12-23 12:36:03
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吗子

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
每管酶切体系增大质粒量，比如20 uL体系里加10 uL质粒；然后多切几管质粒，比如10管。
你切的质粒太少了。
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深秋
7楼2015-12-24 16:16:44
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Huobol

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
同意7楼，你切的质粒模板可能太少了，增加模板量，多做几管再胶回收吧！模板量也别加太多，双酶切不完全的话会出现3条的，我曾经出现过，模板加多了，吼吼~
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让羽毛再飞一会儿
8楼2015-12-25 09:35:38
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Huobol at 2015-12-25 09:35:38
同意7楼，你切的质粒模板可能太少了，增加模板量，多做几管再胶回收吧！模板量也别加太多，双酶切不完全的话会出现3条的，我曾经出现过，模板加多了，吼吼~

嗯，昨天重新抽了质粒，我感觉应该就是浓度的问题，回收出来了，谢谢

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9楼2015-12-25 10:50:34
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panyax

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 吗子 at 2015-12-24 16:16:44
每管酶切体系增大质粒量，比如20 uL体系里加10 uL质粒；然后多切几管质粒，比如10管。
你切的质粒太少了。

嗯，重新抽了质粒再酶切回收就成功了……

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10楼2015-12-25 10:51:15
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