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夏末忆雪

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[求助] 请各位专业人士帮忙看看这个体外转录探针的实验结果，为什么会这样啊已有1人参与

做了两个多星期的体外转录探针的实验了，实验结果一次比一次垃圾，不知道什么原因，请各位有经验的朋友帮忙看看，非常感谢！
没有用试剂盒，转录体系是按照rna聚合酶的说明书配置：模板，酶，buffer，atp，ctp，utp，gtp，rna酶抑制剂，然后37度，2h，60v电泳15min。结果如下：单酶切质粒的时候感觉条带很清晰的，回收后进行体外转录就一直没有结果，开始的时候下面还有类似降解的条带，后来连条带都没有了，只有模板的条带，再到后面连电泳的胶都很脏。电泳用的loading buffer虽然不是专门跑rna的，但是却是开了一管新的，专用道，没有用于其他的电泳；电泳缓冲液也是用depc水配置的，（depc500ul+500ml水，摇床摇过夜，高压灭菌60min），周围没有人做这个，如果有做的麻烦帮忙分析分析，万分感激！

单酶切质粒的电泳图，右边三个泳道全部回收到一管中

开始的结果与最左边的泳道相同，从某一次成为这样后就开始没有条带了

之后的转录结果，只有模版条带，没有转录产物

电泳之后这个结果，看着胶很脏，换了新的电泳缓冲液还是这样

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【求助/交流】体外转录合成Dig探针已经有4人回复

1楼 2013-12-18 09:24:19

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fuyuandj86

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【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-01-27 20:00:04
夏末忆雪: 金币+25 2014-04-01 19:02:01

我没有自己配过,都是用试剂盒,所以只能给点建议吧
1. 按理说产物应该比摸板多, 20ul的反应体系, 我用试剂盒是加1ug的摸板大概能有10ug的产物
2. 短的产物不太好转录, 比较短的(<500nt)需要延长反应时间2-4小时
3. 你可以加Dnase把摸板降解掉
3. 既然你刚开始做成功了,后来做不出来了就只能找区别了. 比如说你现在用的摸板和以前的摸板是同一批做的吗

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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.

2楼2013-12-18 10:46:08

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引用回帖:

2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-12-18 10:46:08
我没有自己配过,都是用试剂盒,所以只能给点建议吧
1. 按理说产物应该比摸板多, 20ul的反应体系, 我用试剂盒是加1ug的摸板大概能有10ug的产物
2. 短的产物不太好转录, 比较短的(<500nt)需要延长反应时间2-4小时 ...

首先谢谢你，我的产物应该是700+bp,我的模版是重新酶切的，但是酶切的时间，浓度等各种条件都跟开始时一样。或者说我所有的实验的各种试剂（除了模版），体系，时间都是一样的。最让我奇怪的是那张只有一个泳道有条带的图，那三个泳道东西都是一样的，就是酶不同，而我之后再用这个酶做还是没有结果。

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3楼2013-12-18 11:26:08

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