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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

[求助] 请各位专业人士帮忙看看这个体外转录探针的实验结果,为什么会这样啊 已有1人参与

做了两个多星期的体外转录探针的实验了,实验结果一次比一次垃圾,不知道什么原因,请各位有经验的朋友帮忙看看,非常感谢!
没有用试剂盒,转录体系是按照rna聚合酶的说明书配置:模板,酶,buffer,atp,ctp,utp,gtp,rna酶抑制剂,然后37度,2h,60v电泳15min。结果如下:单酶切质粒的时候感觉条带很清晰的,回收后进行体外转录就一直没有结果,开始的时候下面还有类似降解的条带,后来连条带都没有了,只有模板的条带,再到后面连电泳的胶都很脏。电泳用的loading buffer虽然不是专门跑rna的,但是却是开了一管新的,专用道,没有用于其他的电泳;电泳缓冲液也是用depc水配置的,(depc500ul+500ml水,摇床摇过夜,高压灭菌60min),周围没有人做这个,如果有做的麻烦帮忙分析分析,万分感激!
请各位专业人士帮忙看看这个体外转录探针的实验结果,为什么会这样啊
单酶切质粒的电泳图,右边三个泳道全部回收到一管中


请各位专业人士帮忙看看这个体外转录探针的实验结果,为什么会这样啊-1
开始的结果与最左边的泳道相同,从某一次成为这样后就开始没有条带了


请各位专业人士帮忙看看这个体外转录探针的实验结果,为什么会这样啊-2
之后的转录结果,只有模版条带,没有转录产物


请各位专业人士帮忙看看这个体外转录探针的实验结果,为什么会这样啊-3
电泳之后这个结果,看着胶很脏,换了新的电泳缓冲液还是这样
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-01-27 20:00:04
夏末忆雪: 金币+25 2014-04-01 19:02:01
我没有自己配过,都是用试剂盒,所以只能给点建议吧
1. 按理说产物应该比摸板多, 20ul的反应体系, 我用试剂盒是加1ug的摸板大概能有10ug的产物
2. 短的产物不太好转录, 比较短的(<500nt)需要延长反应时间2-4小时
3. 你可以加Dnase把摸板降解掉
3. 既然你刚开始做成功了,后来做不出来了就只能找区别了. 比如说你现在用的摸板和以前的摸板是同一批做的吗
The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
2楼2013-12-18 10:46:08
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夏末忆雪

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2013-12-18 10:46:08
我没有自己配过,都是用试剂盒,所以只能给点建议吧
1. 按理说产物应该比摸板多, 20ul的反应体系, 我用试剂盒是加1ug的摸板大概能有10ug的产物
2. 短的产物不太好转录, 比较短的(<500nt)需要延长反应时间2-4小时 ...

首先谢谢你,我的产物应该是700+bp,我的模版是重新酶切的,但是酶切的时间,浓度等各种条件都跟开始时一样。或者说我所有的实验的各种试剂(除了模版),体系,时间都是一样的。最让我奇怪的是那张只有一个泳道有条带的图,那三个泳道东西都是一样的,就是酶不同,而我之后再用这个酶做还是没有结果。
3楼2013-12-18 11:26:08
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15800711862

新虫 (初入文坛)

你的实验出结果了吗?我现在遇到了同样的问题
4楼2017-08-28 10:30:52
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