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[交流]
重叠PCR中出现大量非特异性条带
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最近在做三个基因的重叠PCR，gene1：673bp gene2：1310bp gene3：667bp 重叠片段为20bp 。引物设计如下（粗体部分为重叠片段）： gene1p1：GCTGGGAATGAGCTACGGCTC gene1p2：CAGCTCCAGCCTACACAATCGCTTTAGCGATACGCGGCAACAA gene2p1：AGCGATTGTGTAGGCTGGAGC gene2p2：TTTCTGCTGGAATGAAGACCGTTTTCCGGGGATCCGTCGACCT gene3p1：AACGGTCTTCATTCCAGCAG gene3p2：GCAACGACCAATCGGACCAT 模版是通过高保真酶PCR并且切胶回收。起初将三基因放入同一体系中PCR，前15循环不加引物（退火56℃ l min 延伸72℃ 2min50s )后30个循环加gene1p1、gene3p2（退火54℃ l min 延伸72℃ 3 min30s ）没有成功，后尝试先两两连接。 此次都是将模版与引物同时加入 gene1+gene2、与gene2+gene3的PCR条件均为 94℃ 5min 94℃ 40s 53℃ lmin 72℃ 2min30s 30个循环 72℃ 18min 电泳验证如”图片1“ 1 为gene1+gene2 2为gene2+gene3 感觉在1882bp附近的是目的条带，但底下的非特异性条带也太亮了吧。 将目的条带切胶回收之后又PCR，目的条带依旧不明显，下面的非特异性条带依旧很亮。（PCR都是热启动的） 我每次所加的模版比例是按照跑胶后的亮度估摸着加的，没有进攻严格的软件分析，是否会对实验有影响。 非常希望得到大家的帮助！！！！！  图片1.png |
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