应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠PCR中出现大量非特异性条带
61/1返回列表
查看: 1285  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

海尤希

新虫 (小有名气)

[交流] 重叠PCR中出现大量非特异性条带

最近在做三个基因的重叠PCR，gene1：673bp gene2：1310bp gene3：667bp 重叠片段为20bp 。引物设计如下（粗体部分为重叠片段）：
gene1p1：GCTGGGAATGAGCTACGGCTC
gene1p2：CAGCTCCAGCCTACACAATCGCTTTAGCGATACGCGGCAACAA
gene2p1：AGCGATTGTGTAGGCTGGAGC
gene2p2：TTTCTGCTGGAATGAAGACCGTTTTCCGGGGATCCGTCGACCT
gene3p1：AACGGTCTTCATTCCAGCAG
gene3p2：GCAACGACCAATCGGACCAT
模版是通过高保真酶PCR并且切胶回收。起初将三基因放入同一体系中PCR，前15循环不加引物（退火56℃  l min 延伸72℃  2min50s  )后30个循环加gene1p1、gene3p2（退火54℃  l min 延伸72℃  3 min30s ）没有成功，后尝试先两两连接。

此次都是将模版与引物同时加入
gene1+gene2、与gene2+gene3的PCR条件均为
94℃  5min                  
94℃  40s
53℃  lmin
72℃  2min30s    30个循环
72℃  18min

电泳验证如”图片1“ 1 为gene1+gene2   2为gene2+gene3
感觉在1882bp附近的是目的条带，但底下的非特异性条带也太亮了吧。
将目的条带切胶回收之后又PCR，目的条带依旧不明显，下面的非特异性条带依旧很亮。（PCR都是热启动的）

我每次所加的模版比例是按照跑胶后的亮度估摸着加的，没有进攻严格的软件分析，是否会对实验有影响。

非常希望得到大家的帮助！！！！！

图片1.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2012-08-31 13:03:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王礼鹏

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能的原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.Mg2+浓度偏高4.退火温度偏低5.循环次数过多
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-31 20:39:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

海尤希

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-31 20:39:34
可能的原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.Mg2+浓度偏高4.退火温度偏低5.循环次数过多

mg2+在buffer里面买来时就已经加好的，想问下循环次数过多了吗？那样会有什么影响呢？
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-01 22:50:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

日光海

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我目前也是这样，我是上下游同源臂各160bp左右，中间2700bp。也是链接产物太淡了，下面的非特异性条带特别亮。我目前准备换引物后在做做看。
赞一下 回复此楼
4楼2015-08-20 15:48:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

加油小小帅

禁虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
5楼2021-01-21 15:25:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

加油小小帅

禁虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
6楼2021-01-21 15:27:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 海尤希 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂 +11 枫桥ZL 2026-03-18 13/650 2026-03-22 20:26 by edmund7
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +6 tcxiaoxx 2026-03-20 6/300 2026-03-22 20:23 by edmund7
[考研] 298求调剂 +6 上岸6666@ 2026-03-20 6/300 2026-03-22 20:21 by edmund7
[考研] 324求调剂 +6 lucky呀呀呀鸭 2026-03-20 6/300 2026-03-22 16:01 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +3 13341 2026-03-20 3/150 2026-03-21 18:28 by 学员8dgXkO
[考研] 0703化学297求调剂 +3 Daisy☆ 2026-03-20 3/150 2026-03-21 17:45 by ColorlessPI
[基金申请] 学校已经提交到NSFC，还能修改吗？ 40+4 babangida 2026-03-19 9/450 2026-03-21 16:12 by babangida
[考研] 332求调剂 +3 凤凰院丁真 2026-03-20 3/150 2026-03-21 10:27 by luoyongfeng
[考研] 299求调剂 +6 △小透明* 2026-03-17 6/300 2026-03-21 02:42 by JourneyLucky
[考研] 求调剂 +3 Ma_xt 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:05 by JourneyLucky
[考研] 一志愿武理材料305分求调剂 +6 想上岸的鲤鱼 2026-03-18 7/350 2026-03-21 01:03 by JourneyLucky
[考研] 一志愿 西北大学 ，070300化学学硕，总分287，双非一本，求调剂。 +3 晨昏线与星海 2026-03-18 3/150 2026-03-21 00:46 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕英一数二306 +7 z1z2z3879 2026-03-18 7/350 2026-03-20 23:48 by JourneyLucky
[考研] 考研调剂求学校推荐 +3 伯乐29 2026-03-18 5/250 2026-03-20 22:59 by JourneyLucky
[考研] 求调剂，一志愿:南京航空航天大学大学 ，080500材料科学与工程学硕，总分289分 +4 @taotao 2026-03-19 4/200 2026-03-20 22:14 by JourneyLucky
[考研] 材料与化工专硕调剂 +7 heming3743 2026-03-16 7/350 2026-03-20 19:31 by zhukairuo
[考研] 081700化工学硕调剂 +3 【1】 2026-03-16 3/150 2026-03-19 23:40 by edmund7
[考研] 0703化学调剂 +5 pupcoco 2026-03-17 8/400 2026-03-19 13:58 by houyaoxu
[论文投稿] 有没有大佬发小论文能带我个二作 +3 增锐漏人 2026-03-17 4/200 2026-03-17 09:26 by xs74101122
[考研] 考研调剂 +3 淇ya_~ 2026-03-17 5/250 2026-03-17 09:25 by Winj1e
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭