24小时热门版块排行榜    

查看: 1288  |  回复: 5

海尤希

新虫 (小有名气)


[交流] 重叠PCR中出现大量非特异性条带

最近在做三个基因的重叠PCR,gene1:673bp gene2:1310bp gene3:667bp 重叠片段为20bp 。引物设计如下(粗体部分为重叠片段):
gene1p1:GCTGGGAATGAGCTACGGCTC
gene1p2:CAGCTCCAGCCTACACAATCGCTTTAGCGATACGCGGCAACAA
gene2p1:AGCGATTGTGTAGGCTGGAGC
gene2p2:TTTCTGCTGGAATGAAGACCGTTTTCCGGGGATCCGTCGACCT
gene3p1:AACGGTCTTCATTCCAGCAG
gene3p2:GCAACGACCAATCGGACCAT
模版是通过高保真酶PCR并且切胶回收。起初将三基因放入同一体系中PCR,前15循环不加引物(退火56℃  l min 延伸72℃  2min50s  )后30个循环加gene1p1、gene3p2(退火54℃  l min 延伸72℃  3 min30s )没有成功,后尝试先两两连接。

此次都是将模版与引物同时加入
gene1+gene2、与gene2+gene3的PCR条件均为
94℃  5min                  
94℃  40s
53℃  lmin
72℃  2min30s    30个循环
72℃  18min

电泳验证如”图片1“ 1 为gene1+gene2   2为gene2+gene3
感觉在1882bp附近的是目的条带,但底下的非特异性条带也太亮了吧。
将目的条带切胶回收之后又PCR,目的条带依旧不明显,下面的非特异性条带依旧很亮。(PCR都是热启动的)

我每次所加的模版比例是按照跑胶后的亮度估摸着加的,没有进攻严格的软件分析,是否会对实验有影响。

非常希望得到大家的帮助!!!!!

图片1.png
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

» 抢金币啦!回帖就可以得到:

查看全部散金贴

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

王礼鹏

金虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可能的原因:1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.Mg2+浓度偏高4.退火温度偏低5.循环次数过多
2楼2012-08-31 20:39:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

海尤希

新虫 (小有名气)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-31 20:39:34
可能的原因:1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.Mg2+浓度偏高4.退火温度偏低5.循环次数过多

mg2+在buffer里面买来时就已经加好的,想问下循环次数过多了吗?那样会有什么影响呢?
3楼2012-09-01 22:50:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

日光海

铜虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我目前也是这样,我是上下游同源臂各160bp左右,中间2700bp。也是链接产物太淡了,下面的非特异性条带特别亮。我目前准备换引物后在做做看。
4楼2015-08-20 15:48:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

5楼2021-01-21 15:25:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

6楼2021-01-21 15:27:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 海尤希 的主题更新
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 08工学调剂 +6 用户573181 2026-03-20 9/450 2026-03-23 10:08 by 汪!?!
[考研] 070300化学求调剂 +5 苑豆豆 2026-03-20 5/250 2026-03-23 09:39 by guoliang1816
[考研] 323求调剂 +6 洼小桶 2026-03-18 6/300 2026-03-23 00:29 by king123!
[考研] 287求调剂 +8 晨昏线与星海 2026-03-19 9/450 2026-03-22 17:01 by i_cooler
[考研] 308求调剂 +3 墨墨漠 2026-03-21 3/150 2026-03-22 16:54 by i_cooler
[考研] 一志愿中南化学(0703)总分337求调剂 +9 niko- 2026-03-19 10/500 2026-03-22 16:08 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +7 Auroracx 2026-03-22 7/350 2026-03-22 12:38 by 素颜倾城1988
[考研] 生物学一志愿985,分数349求调剂 +4 zxts12 2026-03-21 7/350 2026-03-22 09:57 by zxts12
[考研] 286求调剂 +10 Faune 2026-03-21 10/500 2026-03-21 23:34 by 314126402
[考研] 化学调剂 +5 yzysaa 2026-03-21 5/250 2026-03-21 22:12 by peike
[考研] 材料学硕333求调剂 +3 北道巷 2026-03-18 3/150 2026-03-21 18:17 by 学员8dgXkO
[考研] 307求调剂 +3 余意卿 2026-03-18 3/150 2026-03-21 17:31 by ColorlessPI
[考研] 求调剂 +3 .m.. 2026-03-21 4/200 2026-03-21 16:25 by barlinike
[考研] 265求调剂 +12 梁梁校校 2026-03-19 14/700 2026-03-21 13:38 by lature00
[考研] 初始318分求调剂(有工作经验) +3 1911236844 2026-03-17 3/150 2026-03-21 02:33 by JourneyLucky
[考研] 材料专硕英一数二306 +7 z1z2z3879 2026-03-18 7/350 2026-03-20 23:48 by JourneyLucky
[考研] 288求调剂 +16 于海海海海 2026-03-19 16/800 2026-03-20 22:28 by JourneyLucky
[考研] 一志愿西南交通 专硕 材料355 本科双非 求调剂 +5 西南交通专材355 2026-03-19 5/250 2026-03-20 21:10 by JourneyLucky
[考研] 295材料求调剂,一志愿武汉理工085601专硕 +5 Charlieyq 2026-03-19 5/250 2026-03-20 20:35 by JourneyLucky
[考研] 材料,纺织,生物(0856、0710),化学招生啦 +3 Eember. 2026-03-17 9/450 2026-03-18 10:28 by Eember.
信息提示
请填处理意见