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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 重叠PCR中出现大量非特异性条带
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海尤希

新虫 (小有名气)

[交流] 重叠PCR中出现大量非特异性条带

最近在做三个基因的重叠PCR，gene1：673bp gene2：1310bp gene3：667bp 重叠片段为20bp 。引物设计如下（粗体部分为重叠片段）：
gene1p1：GCTGGGAATGAGCTACGGCTC
gene1p2：CAGCTCCAGCCTACACAATCGCTTTAGCGATACGCGGCAACAA
gene2p1：AGCGATTGTGTAGGCTGGAGC
gene2p2：TTTCTGCTGGAATGAAGACCGTTTTCCGGGGATCCGTCGACCT
gene3p1：AACGGTCTTCATTCCAGCAG
gene3p2：GCAACGACCAATCGGACCAT
模版是通过高保真酶PCR并且切胶回收。起初将三基因放入同一体系中PCR，前15循环不加引物（退火56℃  l min 延伸72℃  2min50s  )后30个循环加gene1p1、gene3p2（退火54℃  l min 延伸72℃  3 min30s ）没有成功，后尝试先两两连接。

此次都是将模版与引物同时加入
gene1+gene2、与gene2+gene3的PCR条件均为
94℃  5min                  
94℃  40s
53℃  lmin
72℃  2min30s    30个循环
72℃  18min

电泳验证如”图片1“ 1 为gene1+gene2   2为gene2+gene3
感觉在1882bp附近的是目的条带，但底下的非特异性条带也太亮了吧。
将目的条带切胶回收之后又PCR，目的条带依旧不明显，下面的非特异性条带依旧很亮。（PCR都是热启动的）

我每次所加的模版比例是按照跑胶后的亮度估摸着加的，没有进攻严格的软件分析，是否会对实验有影响。

非常希望得到大家的帮助！！！！！

图片1.png
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1楼2012-08-31 13:03:39
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海尤希

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王礼鹏 at 2012-08-31 20:39:34
可能的原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.Mg2+浓度偏高4.退火温度偏低5.循环次数过多

mg2+在buffer里面买来时就已经加好的，想问下循环次数过多了吗？那样会有什么影响呢？
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3楼2012-09-01 22:50:09
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王礼鹏

金虫 (小有名气)
★
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可能的原因：1.引物特异性差2.模板或引物浓度过高3.Mg2+浓度偏高4.退火温度偏低5.循环次数过多
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2楼2012-08-31 20:39:34
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日光海

铜虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我目前也是这样，我是上下游同源臂各160bp左右，中间2700bp。也是链接产物太淡了，下面的非特异性条带特别亮。我目前准备换引物后在做做看。
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4楼2015-08-20 15:48:08
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加油小小帅

禁虫
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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5楼2021-01-21 15:25:03
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