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1楼2015-12-13 11:05:06

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lutu2013

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建议用 takara 的primeSTAR MAX做PCR 一般都可以跑出来

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2楼2015-12-13 14:43:52

科学小覃

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7楼: Originally posted by siyuansing at 2015-12-13 23:50:34
模板1μl ，600ng/μl
上下引物各1μl，10μM/L=10nM/mL=10pM/μl
水7μl
takara的Ex TaqMix 10μl
总共20μl的体系，模板是基因组

酶切位点和模板不配对，没有必要计算Tm值的变化吧？而且我有试过提高退火 ...

酶切位点最初不参加模版配对，但当扩增出新的序列后，新的序列作为模版是有酶切位点的，也参与引物配对。所以，可以先以不加酶切位点的退火温度反应3-5个循环，之后再以加酶切位点后的退火温度进行扩增。

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生物科学

8楼2015-12-14 08:25:07

生命之谜

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17楼: Originally posted by 781055707 at 2015-12-16 17:41:19
你设计引物是为了连到载体上吧，这样的话你能用3步法链接。
1.设计一对引物先在你原有要链接质粒上加入2个没有的酶切位点BAMHI和SALI
上游 AAGCTT （ hindIII ）+GGATCC(BAMHI)+兼并引物
下 ...

您这个引物二聚体现象太严重，需要修改…

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18楼2015-12-16 18:14:49

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shanyue00

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体系？

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耐心说话，好好说话！

3楼2015-12-13 18:15:55

sdugds

。。

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4楼2015-12-13 18:21:52

科学小覃

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siyuansing: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 按你说的，果然做出来了，是二聚体的问题 2015-12-18 00:48:52

反应条件怎么设定的？要考虑加酶切位点后引物TM值的变化。

生物科学

5楼2015-12-13 20:06:13

siyuansing

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3楼: Originally posted by shanyue00 at 2015-12-13 18:15:55
体系？

模板1μl ，600ng/μl
上下引物各1μl，10μM/L=10nM/mL=10pM/μl
水7μl
takara的Ex TaqMix 10μl
总共20μl的体系

6楼2015-12-13 23:49:09

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5楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-13 20:06:13
反应条件怎么设定的？要考虑加酶切位点后引物TM值的变化。

模板1μl ，600ng/μl
上下引物各1μl，10μM/L=10nM/mL=10pM/μl
水7μl
takara的Ex TaqMix 10μl
总共20μl的体系，模板是基因组

酶切位点和模板不配对，没有必要计算Tm值的变化吧？而且我有试过提高退火温度，还是扩增不出来。

7楼2015-12-13 23:50:34

siyuansing

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8楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-14 08:25:07
酶切位点最初不参加模版配对，但当扩增出新的序列后，新的序列作为模版是有酶切位点的，也参与引物配对。所以，可以先以不加酶切位点的退火温度反应3-5个循环，之后再以加酶切位点后的退火温度进行扩增。...

很有道理，我去试试

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9楼2015-12-14 08:38:58

siyuansing

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想了一下，低退火温度扩增不出来，且没有非特异性扩增，提高退火温度不是更应该出不来？反正现在也没有什么好的解释，我还是试一下，总比在这浪费时间强。

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10楼2015-12-14 09:11:20