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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 加了酶切位点的引物扩增不出目的片段
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siyuansing

银虫 (小有名气)

[求助] 加了酶切位点的引物扩增不出目的片段 已有6人参与

扩增一个800bp的片段，引物的5‘端不加酶切位点就能扩增出来，加了酶切位点就扩增不出来是什么情况？
如图，从左向右依次是marker、无酶切位点的引物、有酶切位点的引物、有酶切位点和保护碱基的引物
引物列表如下
上引物无酶切位点：GTACAGACAAGAAACGCGTCA
下引物无酶切位点：TGGGAAGAAGACAGAGCTCTG

上引物+酶切位点：AAGCTTGTACAGACAAGAAACGCGTCA
下引物+酶切位点：CCTGCAGGTGGGAAGAAGACAGAGCTCTG

上引物+酶切位点+保护碱基：GGCAAGCTTGTACAGACAAGAAACGCGTCA
下引物+酶切位点+保护碱基：AAAACCTGCAGGTGGGAAGAAGACAGAGCTCTG
以上引物都是从5’端→3'端

后来实在扩增不出来，放弃前段300bp，在该800bp片段扩增后面500bp，改变上引物、保留下引物，依然是只有无酶切位点才能扩增的出来，加了酶切位点以后就扩增不出来。这个问题困扰了半个月了，求大神解救，万分感激。

加了酶切位点的引物扩增不出目的片段
PC 2015-12-06 12 时 40 分 土曲霉pdc启动子.jpg
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1楼 2015-12-13 11:05:06
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lutu2013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议用 takara 的primeSTAR MAX做PCR   一般都可以跑出来
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2楼2015-12-13 14:43:52
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科学小覃

木虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by siyuansing at 2015-12-13 23:50:34
模板1μl ，600ng/μl
上下引物各1μl，10μM/L=10nM/mL=10pM/μl
水7μl
takara的Ex TaqMix 10μl
总共20μl的体系，模板是基因组

酶切位点和模板不配对，没有必要计算Tm值的变化吧？而且我有试过提高退火 ...

酶切位点最初不参加模版配对，但当扩增出新的序列后，新的序列作为模版是有酶切位点的，也参与引物配对。所以，可以先以不加酶切位点的退火温度反应3-5个循环，之后再以加酶切位点后的退火温度进行扩增。
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生物科学
8楼2015-12-14 08:25:07
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生命之谜

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 781055707 at 2015-12-16 17:41:19
你设计引物是为了连到载体上吧，这样的话你能用3步法链接。
1.设计一对引物   先在你原有要链接质粒上加入2个没有的酶切位点BAMHI和SALI
上游  AAGCTT （ hindIII ）+GGATCC(BAMHI)+兼并引物
               下 ...

您这个引物二聚体现象太严重，需要修改…

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18楼2015-12-16 18:14:49
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普通回帖

shanyue00

铁杆木虫 (著名写手)
体系？

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耐心说话，好好说话！
3楼2015-12-13 18:15:55
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sdugds
。。

发自小木虫Android客户端
4楼2015-12-13 18:21:52
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科学小覃

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
siyuansing: 金币+30, ★★★★★最佳答案, 按你说的，果然做出来了，是二聚体的问题 2015-12-18 00:48:52
反应条件怎么设定的？要考虑加酶切位点后引物TM值的变化。
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生物科学
5楼2015-12-13 20:06:13
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shanyue00 at 2015-12-13 18:15:55
体系？

模板1μl ，600ng/μl
上下引物各1μl，10μM/L=10nM/mL=10pM/μl
水7μl
takara的Ex TaqMix 10μl
总共20μl的体系
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6楼2015-12-13 23:49:09
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-13 20:06:13
反应条件怎么设定的？要考虑加酶切位点后引物TM值的变化。

模板1μl ，600ng/μl
上下引物各1μl，10μM/L=10nM/mL=10pM/μl
水7μl
takara的Ex TaqMix 10μl
总共20μl的体系，模板是基因组

酶切位点和模板不配对，没有必要计算Tm值的变化吧？而且我有试过提高退火温度，还是扩增不出来。
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7楼2015-12-13 23:50:34
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-14 08:25:07
酶切位点最初不参加模版配对，但当扩增出新的序列后，新的序列作为模版是有酶切位点的，也参与引物配对。所以，可以先以不加酶切位点的退火温度反应3-5个循环，之后再以加酶切位点后的退火温度进行扩增。...

很有道理，我去试试

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9楼2015-12-14 08:38:58
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-14 08:25:07
酶切位点最初不参加模版配对，但当扩增出新的序列后，新的序列作为模版是有酶切位点的，也参与引物配对。所以，可以先以不加酶切位点的退火温度反应3-5个循环，之后再以加酶切位点后的退火温度进行扩增。...

想了一下，低退火温度扩增不出来，且没有非特异性扩增，提高退火温度不是更应该出不来？反正现在也没有什么好的解释，我还是试一下，总比在这浪费时间强。

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10楼2015-12-14 09:11:20
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