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siyuansing银虫 (小有名气)
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[求助]
加了酶切位点的引物扩增不出目的片段 已有6人参与
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扩增一个800bp的片段，引物的5‘端不加酶切位点就能扩增出来，加了酶切位点就扩增不出来是什么情况？ 如图，从左向右依次是marker、无酶切位点的引物、有酶切位点的引物、有酶切位点和保护碱基的引物 引物列表如下 上引物无酶切位点：GTACAGACAAGAAACGCGTCA 下引物无酶切位点：TGGGAAGAAGACAGAGCTCTG 上引物+酶切位点：AAGCTTGTACAGACAAGAAACGCGTCA 下引物+酶切位点：CCTGCAGGTGGGAAGAAGACAGAGCTCTG 上引物+酶切位点+保护碱基：GGCAAGCTTGTACAGACAAGAAACGCGTCA 下引物+酶切位点+保护碱基：AAAACCTGCAGGTGGGAAGAAGACAGAGCTCTG 以上引物都是从5’端→3'端 后来实在扩增不出来，放弃前段300bp，在该800bp片段扩增后面500bp，改变上引物、保留下引物，依然是只有无酶切位点才能扩增的出来，加了酶切位点以后就扩增不出来。这个问题困扰了半个月了，求大神解救，万分感激。  PC 2015-12-06 12 时 40 分 土曲霉pdc启动子.jpg |
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【答案】应助回帖
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你设计引物是为了连到载体上吧，这样的话你能用3步法链接。 1.设计一对引物 先在你原有要链接质粒上加入2个没有的酶切位点BAMHI和SALI 上游 AAGCTT （ hindIII ）+GGATCC(BAMHI)+兼并引物 下游 CCTGCAGG+GTCGAC(SALI)+兼并引物 在总RNA里扩出一条片段，链接上这两个酶切位点。 2.把你用上引物无酶切位点：GTACAGACAAGAAACGCGTCA 下引物无酶切位点：TGGGAAGAAGACAGAGCTCTG 扩出来的片段连到18T载体上。 3.把连到18T载体上的片段用BAMHI和SALI酶切下来，把你要链接的载体也用BAMHI和SALI 双酶切，链接。 |
17楼2015-12-16 17:41:19
2楼2015-12-13 14:43:52
shanyue00
铁杆木虫 (著名写手)
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3楼2015-12-13 18:15:55
4楼2015-12-13 18:21:52
