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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 加了酶切位点的引物扩增不出目的片段
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siyuansing

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 科学小覃 at 2015-12-14 08:25:07
酶切位点最初不参加模版配对，但当扩增出新的序列后，新的序列作为模版是有酶切位点的，也参与引物配对。所以，可以先以不加酶切位点的退火温度反应3-5个循环，之后再以加酶切位点后的退火温度进行扩增。...

又想了一下，提高退火温度应该可以降低引物二聚体和发卡结构形成的概率。哈哈哈哈，感觉想一想，越想可能越高。谢谢你啦！

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11楼2015-12-14 09:28:58
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scofield111

银虫 (正式写手)
酶切位点选择时不要有多个，5-3方向没错吧，引物设计好，尽量减少错配和二聚体，然后就是酶，taq酶就可以，引物和和模板量.1ul就可以，梯度跑下，模板没问题的话，跑出来妥妥的

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12楼2015-12-14 09:41:11
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shanyue00

铁杆木虫 (著名写手)
加DMSO试试

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耐心说话，好好说话！
13楼2015-12-14 12:13:25
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清水无痕6618
。。

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14楼2015-12-14 12:23:33
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mpa104

新虫 (初入文坛)
这个应该不难扩增，主要问题 在于设计引物的时候加了酶切位点之后的退火，要尽量接近，至于用什么taq酶，个人感觉无所谓
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15楼2015-12-14 15:46:47
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ltf329395464

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

用Touch down随便搞都出来了吧。。多个酶切位点，没啥影响的~
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ONLY I CAN !
16楼2015-12-16 14:57:43
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你设计引物是为了连到载体上吧，这样的话你能用3步法链接。
1.设计一对引物   先在你原有要链接质粒上加入2个没有的酶切位点BAMHI和SALI
上游  AAGCTT （ hindIII ）+GGATCC(BAMHI)+兼并引物
               下游  CCTGCAGG+GTCGAC(SALI)+兼并引物  
在总RNA里扩出一条片段，链接上这两个酶切位点。
2.把你用上引物无酶切位点：GTACAGACAAGAAACGCGTCA
下引物无酶切位点：TGGGAAGAAGACAGAGCTCTG
扩出来的片段连到18T载体上。
3.把连到18T载体上的片段用BAMHI和SALI酶切下来，把你要链接的载体也用BAMHI和SALI
双酶切，链接。
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采菊东篱下，悠然见南山。
17楼2015-12-16 17:41:19
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生命之谜

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 781055707 at 2015-12-16 17:41:19
你设计引物是为了连到载体上吧，这样的话你能用3步法链接。
1.设计一对引物   先在你原有要链接质粒上加入2个没有的酶切位点BAMHI和SALI
上游  AAGCTT （ hindIII ）+GGATCC(BAMHI)+兼并引物
               下 ...

您这个引物二聚体现象太严重，需要修改…

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18楼2015-12-16 18:14:49
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lzq_112233

金虫 (小有名气)
这个问题出现在退火温度上，我也遇到过，酶切位点的Tm值是虚有的，建议用没有酶切位点和保护碱基时引物的Tm值，如果想确定最优的Tm值，那就以不加保护碱基和酶切位点引物的Tm值为中心值做梯度pcr

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19楼2015-12-16 18:49:17
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匿名

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20楼2015-12-16 21:17:56
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