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cynlicious

新虫 (小有名气)

[求助] 电泳跑完胶后样品没有条带,只有最上面一行。是不是PCR做的不对 已有2人参与

跑完后的结果如图:样品没有条带,只有最上面的一行。请问各位大神这可能会是什么原因造成的?
我自己觉得是PCR过程出了问题,有两种可能:第一:引物设计不合理,或者说是公司没能合成好
第二:PCR反应体系和反应条件不合理
PS:我用未做PCR的DNA样品跑胶是有条带出现,但是特别不明显,似乎还有弥散。

电泳跑完胶后样品没有条带,只有最上面一行。是不是PCR做的不对
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电泳跑完胶后样品没有条带,只有最上面一行。是不是PCR做的不对-1
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电泳跑完胶后样品没有条带,只有最上面一行。是不是PCR做的不对-2
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气顺,心顺,事顺。不要有功利心,耶!
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lsy901213

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cynlicious: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-09-22 16:34:33
前面应该是引物二聚体,这样的话就是没p出来。
2楼2015-09-22 15:15:27
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
cynlicious: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2015-09-22 16:34:26
首先引物有问题你可以考虑做个阳性对照(取一点纯菌就可以做,阴性菌比较好做,直接PCR)
PCR反应体系条件不合适那你得列出来看看,基本这个操作都一样,不会有太大问题
前端应该是二聚体过多,或者DNA不纯,减少模板量一般有效
ControlMyself
3楼2015-09-22 15:20:40
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Bonarven

银虫 (初入文坛)

模版稀释了吗 既然模版都有弥散那只能说明你的模版DNA不好,对pcr 影响很大的 引物你应该用primer去分析一下 看看错配率什么的  很多因素都会影响pcr 结果  以及你用的酶活性还有酶反应条件 buffer 的配方 都会有影响

发自小木虫Android客户端
umaledecissionanduvetolivewiththeconcequnces
4楼2015-09-22 16:36:23
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cynlicious

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2015-09-22 15:20:40
首先引物有问题你可以考虑做个阳性对照(取一点纯菌就可以做,阴性菌比较好做,直接PCR)
PCR反应体系条件不合适那你得列出来看看,基本这个操作都一样,不会有太大问题
前端应该是二聚体过多,或者DNA不纯,减少 ...

非常感谢你的帮助。我的反应体系如下:12.5微升2*Es KAPA HiFi HotStar ReadyMix,2.5微升DNA模板,前后引物各5微升。
条件如下:细菌前引物:27F,后引物1492R:95℃ 2min,95℃ 20s,50℃ 30s,72℃ 5min,30个循环,72摄氏度延伸10min。
        真菌:前引物ITS1,后引物ITS4:95℃ 3min,95℃ 30s,60℃ 30s, 72℃ 30s, 25个循环,最后72℃ 10min。
气顺,心顺,事顺。不要有功利心,耶!
5楼2015-09-22 16:42:24
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爱睡猪

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
cynlicious: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-09-25 11:20:34
引用回帖:
5楼: Originally posted by cynlicious at 2015-09-22 16:42:24
非常感谢你的帮助。我的反应体系如下:12.5微升2*Es KAPA HiFi HotStar ReadyMix,2.5微升DNA模板,前后引物各5微升。
条件如下:细菌前引物:27F,后引物1492R:95℃ 2min,95℃ 20s,50℃ 30s,72℃ 5min,30个 ...

没见过引物加这么多的,看你引物是什么浓度了,模板量也多,一共25ul的体系,配比没把握好啊,PCR里面各个成分的终浓度要控制好。需要掌握基础知识,你的这个热启动酶需要多少时间我不清楚,一般2min是不够的,27F和1492R的退火温度56-58合适,产物大小才1.5kb不到,你延伸5min浪费时间,多查阅文献~
ControlMyself
6楼2015-09-24 23:09:30
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cynlicious

新虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2015-09-24 23:09:30
没见过引物加这么多的,看你引物是什么浓度了,模板量也多,一共25ul的体系,配比没把握好啊,PCR里面各个成分的终浓度要控制好。需要掌握基础知识,你的这个热启动酶需要多少时间我不清楚,一般2min是不够的,27F ...

好的,谢谢啦
气顺,心顺,事顺。不要有功利心,耶!
7楼2015-09-25 11:20:12
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DanceMacabre

新虫 (小有名气)

8楼2015-09-25 13:10:42
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