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cynlicious

实习版主

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[求助] 电泳跑完胶后样品没有条带，只有最上面一行。是不是PCR做的不对 已有2人参与

跑完后的结果如图：样品没有条带，只有最上面的一行。请问各位大神这可能会是什么原因造成的？
我自己觉得是PCR过程出了问题，有两种可能：第一：引物设计不合理，或者说是公司没能合成好
第二：PCR反应体系和反应条件不合理
PS：我用未做PCR的DNA样品跑胶是有条带出现，但是特别不明显，似乎还有弥散。

电泳跑完胶后样品没有条带，只有最上面一行。是不是PCR做的不对
P50921-192136.jpg


电泳跑完胶后样品没有条带，只有最上面一行。是不是PCR做的不对-1
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电泳跑完胶后样品没有条带，只有最上面一行。是不是PCR做的不对-2
P50918-113614_mh1442557770111.jpg
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气顺，心顺，事顺。不要有功利心，耶！
1楼 2015-09-22 14:06:28
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lsy901213

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cynlicious: 金币+3, ★★★很有帮助 2015-09-22 16:34:33
前面应该是引物二聚体，这样的话就是没p出来。
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2楼2015-09-22 15:15:27
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爱睡猪

兑换贵宾

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cynlicious: 金币+5, ★★★★★最佳答案 2015-09-22 16:34:26
首先引物有问题你可以考虑做个阳性对照（取一点纯菌就可以做，阴性菌比较好做，直接PCR）
PCR反应体系条件不合适那你得列出来看看，基本这个操作都一样，不会有太大问题
前端应该是二聚体过多，或者DNA不纯，减少模板量一般有效
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ControlMyself
3楼2015-09-22 15:20:40
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Bonarven

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
模版稀释了吗 既然模版都有弥散那只能说明你的模版DNA不好，对pcr 影响很大的 引物你应该用primer去分析一下 看看错配率什么的  很多因素都会影响pcr 结果  以及你用的酶活性还有酶反应条件 buffer 的配方 都会有影响

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umaledecissionanduvetolivewiththeconcequnces
4楼2015-09-22 16:36:23
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cynlicious

专家顾问

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
3楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2015-09-22 15:20:40
首先引物有问题你可以考虑做个阳性对照（取一点纯菌就可以做，阴性菌比较好做，直接PCR）
PCR反应体系条件不合适那你得列出来看看，基本这个操作都一样，不会有太大问题
前端应该是二聚体过多，或者DNA不纯，减少 ...

非常感谢你的帮助。我的反应体系如下：12.5微升2*Es KAPA HiFi HotStar ReadyMix，2.5微升DNA模板，前后引物各5微升。
条件如下：细菌前引物：27F，后引物1492R：95℃ 2min，95℃ 20s，50℃ 30s，72℃ 5min，30个循环，72摄氏度延伸10min。
        真菌：前引物ITS1，后引物ITS4：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s， 72℃ 30s， 25个循环，最后72℃ 10min。
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气顺，心顺，事顺。不要有功利心，耶！
5楼2015-09-22 16:42:24
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爱睡猪

兑换贵宾

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【答案】应助回帖

★ ★
cynlicious: 金币+2, ★★★很有帮助 2015-09-25 11:20:34
引用回帖:
5楼: Originally posted by cynlicious at 2015-09-22 16:42:24
非常感谢你的帮助。我的反应体系如下：12.5微升2*Es KAPA HiFi HotStar ReadyMix，2.5微升DNA模板，前后引物各5微升。
条件如下：细菌前引物：27F，后引物1492R：95℃ 2min，95℃ 20s，50℃ 30s，72℃ 5min，30个 ...

没见过引物加这么多的，看你引物是什么浓度了，模板量也多，一共25ul的体系，配比没把握好啊，PCR里面各个成分的终浓度要控制好。需要掌握基础知识，你的这个热启动酶需要多少时间我不清楚，一般2min是不够的，27F和1492R的退火温度56-58合适，产物大小才1.5kb不到，你延伸5min浪费时间，多查阅文献~
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ControlMyself
6楼2015-09-24 23:09:30
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cynlicious

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
引用回帖:
6楼: Originally posted by 爱睡猪 at 2015-09-24 23:09:30
没见过引物加这么多的，看你引物是什么浓度了，模板量也多，一共25ul的体系，配比没把握好啊，PCR里面各个成分的终浓度要控制好。需要掌握基础知识，你的这个热启动酶需要多少时间我不清楚，一般2min是不够的，27F ...

好的，谢谢啦
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气顺，心顺，事顺。不要有功利心，耶！
7楼2015-09-25 11:20:12
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DanceMacabre

版主

优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！优秀！！有木有！！！
模板被污染了

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8楼2015-09-25 13:10:42
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