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zoe回望铁杆木虫 (正式写手)
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为什么SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳跑出来老是一条线，没有条带（mark也跑不出来） 已有7人参与
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用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳跑蛋白质，不知为什么每次都跑不开，在浓缩胶的时候明显还看见样品间的间隔，但是到了分离胶就跑在一起了，就成了一条蓝色的线（溴酚蓝配液指示），而且跑着跑着蓝色就变黄色了，在机器上读出来只有一条亮带，其他的就什么都没有了，之前以为是浓度不对，所以分离胶7、5%10%15%都跑过，结果也是一样的，样品浓度也是稀释前后电泳效果一样，pH是6、8和8、9，染色的时候也加了B-巯基乙醇的。染色（用的是考然）脱色之后还是一条线，没有任何条带（还有就是我发现我的胶的颜色脱不下来，还是蓝色的，以为时间不够所以有脱过一夜但还是不行）。下面是我的胶体配方，7.5%、10%都跑过。我的蛋白质一次都没跑分开过，电脑上看都是只有一条亮的线，那条线就是上图中的绿色线（以下图做说明），前后半月都在跑胶，可能跑了有40多块，但是都没有一块分开的。前天点了mark，mark是新买的，还是没有跑出来（这个是不是就证明是我胶的原因？能不能给我个胶的配方啊，详细点的）。因为这个原因，我实验一直进行不下去，好着急啊，谢谢。这些是咋回事？谢谢解答~~ 这是胶的配方  这是刚刚跑完的样子 |
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zoe回望
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样品有好几种处理方法，我把具体的贴出来你看看（这是我申请课题里面的，可能字有点多），不过确实有TCA这。 1、TCA-丙酮沉淀法 取一定量的土壤，加入4倍体积的预冷丙酮溶液，充分振荡摇匀后在-20℃冰箱中放置2h沉淀蛋白，然后4℃，12 000 r /min 离心30min。弃上清液，收集沉淀。加入2mL预冷的丙酮溶液，充分振荡混匀，- 20℃放置1h，清洗沉淀，4℃，12 000 r /min 离心15min。重复清洗3次。弃上清液，收集沉淀，然后置于-20℃冰箱中，使丙酮完全挥发。 2、酚-NaOH-醋酸铵-丙酮法 取5g土壤，加入10 mL 0.1mol /L的NaOH溶液，20℃振荡30min，之后在12000 r/min，20℃下离心10min，取6mL上清液，加入16mL液态酚和10mL去离水，20℃振荡60min，10000 r/min，20℃ 下离心10min，吸取15mL酚相，并加入15 mL去离子水，20℃振荡50min并离心，吸取15mL酚相并加入5倍体积的0.1 mol /L醋酸铵（用甲醇配置），-18℃过夜，后在12000 r/min，4℃下离心10min，获得的颗粒用0.1 mol /L醋酸铵洗涤，-18℃沉淀15min，之后离心，后用80%丙酮洗涤2次，然后置于-20℃冰箱中至丙酮挥发完全。 3、差速离心法（间接法） 取20g土壤样品，放入50ml离心管中，加入20ml冷的PBS缓冲液并放置在冰上，用混合式匀浆器匀浆30s,间隔后再处理30s，在2500g下低速离心5min，上清液收集在新的50ml的离心管。土壤沉淀重新加20ml冷的PBS液，同上操作步骤，合并两次的提取上清液，在4 ℃、10 000 ×g离心10min。离心后弃去上清，沉淀物中加入250ul冷的PBS ，涡旋后转移至2ml微量离心管中。在第一次的沉淀管中再加入250μL PBS，收集剩余的细胞残留物，收集合并2次的溶液。然后在10 000×g下离心10mn，收集沉淀并立即在液氮中冷冻。 4、直接裂解土壤/细胞提取宏蛋白质组学的方法 取5 g土壤放在50ml玻璃瓶，加入10ml碱性缓冲（5% SDS，50mM的Tris-HCl，pH值8.5；0.15 M NaCl；0.1mM EDTA； 1mM MgCl2；50mM DTT）。涡旋2-3分钟使其分散，然后沸水浴10min。将所得浆液冷却5分钟，然后转移到50ml Falcon管中，剧烈涡旋混合3min。将涡旋溶液离心（2095×g 10min），将上清液转移到新的管中。向每个试管中，加入冷冻100％三氯乙酸（TCA），并使终浓度为25 ％的TCA。颠倒试管几次，后将试管放置在-10℃条件下过夜。在20 800×g下离心20min，得到浓缩蛋白沉淀，弃去上清液。蛋白质沉淀用1ml冷丙酮（ -10℃ ）洗涤，然后离心（20 800 ×g，10min），丙酮洗涤步骤被重复三次。蛋白质沉淀在空气中干燥，直到所有的丙酮蒸发。 |
7楼2014-12-05 09:36:11
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