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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 食品 » 粮油与蛋白 » 蛋白质SDS-丙烯酰胺凝胶电泳 连mark都没有跑动
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123彭好好

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白质SDS-丙烯酰胺凝胶电泳 连mark都没有跑动

我利用不同的溶液提取了蛋清中的几种不同溶性的蛋白质，进行了两次电泳，全都失败了。所有的点样及mark都没有动，在63V电压下跑了2个多小时。样品没有经过透析处理，就直接和样品缓冲液混合煮沸了5分钟，就开始点样了。不知道具体的问题出在哪里，让我的实验没有办法正常进行，希望能有人帮我解答！！
以下是我所用的胶的配方：
10%分离胶：
水                                     1.9ml
1.5mol/l Tris-Hcl(PH=8.8)   1ml
30%丙烯酰胺                    1.7ml
10%SDS                            50μl
10%AP                               50μl
TEMED                               2μL

浓缩胶：
水                                     1.4ml
1.5mol/l Tris-Hcl(PH=6.8)   0.25ml
30%丙烯酰胺                    0.33ml
10%SDS                            20μl
10%AP                               20μl
TEMED                               2μL
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1楼 2013-08-16 08:59:16
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windygo

木虫 (正式写手)

咸蛋超人

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
123彭好好: 金币+1, ★有帮助 2013-08-20 17:58:59
楼主别着急，先看是否你的电泳槽正负极接反了；
如果都好着的话，那就看下自己的其他东西有没有配错，比如说电极缓冲液等。
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我已经开始怀念那些人，那些事了~
2楼2013-08-16 09:48:13
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123彭好好

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by windygo at 2013-08-16 09:48:13
楼主别着急，先看是否你的电泳槽正负极接反了；
如果都好着的话，那就看下自己的其他东西有没有配错，比如说电极缓冲液等。

电极是没有接反的，我用的电极缓冲配方是：
Tris              3.02g
甘氨酸          14.4g
SDS               1g
水                  1L
我觉得问题应该不出在这里吧？
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3楼2013-08-16 12:03:56
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sunnymen

银虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
hsd3521: 应助指数-1, 非有效应助 2013-08-17 10:20:50
63V电压，怎么选择这个电压，奇怪
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4楼2013-08-16 16:31:11
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sunnymen

银虫 (正式写手)
hsd3521: 屏蔽内容, 不支持QQ群宣传 2013-08-17 10:21:08
本帖内容被屏蔽
5楼2013-08-16 16:33:22
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hujiasong

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
123彭好好: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-08-20 17:57:59
我不知道你用的是哪一本书的参考做的，我们用的是下面那本书做的。

    你这个问题我们实验室也遇到了，查水、电压、电流等问题都不行，最后检测出来是分离胶的浓度不对，让很多样品一直都在浓缩胶里面跑，根本没法在分离胶里分开。你下去仔细查下你的分离胶份的配比，我看了下和我们经常做出来的比例都不一样，你下去好好看下，因为也有很多参考书本身就是错误的，尤其是那些参考文献的。
蛋白质SDS-丙烯酰胺凝胶电泳 连mark都没有跑动
配分离胶的比例


蛋白质SDS-丙烯酰胺凝胶电泳 连mark都没有跑动-1
参考书
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6楼2013-08-16 16:58:07
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123彭好好

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by hujiasong at 2013-08-16 16:58:07
我不知道你用的是哪一本书的参考做的，我们用的是下面那本书做的。

    你这个问题我们实验室也遇到了，查水、电压、电流等问题都不行，最后检测出来是分离胶的浓度不对，让很多样品一直都在浓缩胶里面跑，根本没 ...

我将胶的配方改了一下
10%分离胶：
水                                     2.6ml
3mol/l Tris-Hcl(PH=8.8)         0.6ml
30%丙烯酰胺                    1.7ml
10%SDS                            50μl
10%AP                               50μl
TEMED                               5μL

浓缩胶：
水                                     0.7ml
1.5mol/l Tris-Hcl(PH=6.8)     0.75ml
30%丙烯酰胺                    1.5ml
10%SDS                            30μl
10%AP                              30μl
TEMED                               4μL
但是还没有开始跑胶，不知道结果会怎样
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7楼2013-08-16 17:50:43
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hujiasong

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 123彭好好 at 2013-08-16 17:50:43
我将胶的配方改了一下
10%分离胶：
水                                     2.6ml
3mol/l Tris-Hcl(PH=8.8)         0.6ml
30%丙烯酰胺                    1.7ml
10%SDS                            50μl
...

实验是做出来的。你先按照你的参考去做下看看结果。一个电泳也就一天的时间，只是麻烦你再重新配下你的分离胶了。记住SDS和丙烯酰胺的比例要对，不然maker出不来，一定要找个很正规的参考书来配。
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8楼2013-08-16 18:01:47
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396101466

金虫 (正式写手)

一段遗失的美好

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
123彭好好: 金币+1, ★有帮助 2013-08-20 17:59:51
首先，如果电源接反了，溴酚蓝会从上面溢出，电极缓冲液会变成蓝色；
第二，在电泳过程中溴酚蓝的指示作用比较重要，如果有电流通过的话，溴酚蓝会随着电流向下跑的，如果溴酚蓝没有动，说明胶片中都没通电，根据这个你可以找下原因，没有PAGE胶片无法做进一步分析！
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人生的三大悲剧：不知道选择，不坚持选择，不断选择！
9楼2013-08-16 18:43:33
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windygo

木虫 (正式写手)

咸蛋超人

【答案】应助回帖

hsd3521: 应助指数+1 2013-08-17 10:21:54
好好检查各溶液的配置，还有，溶液配好后，有没有存放在4摄氏度条件下，这个本就是很多细节问题，楼主好运。
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我已经开始怀念那些人，那些事了~
10楼2013-08-17 08:54:43
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