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1楼2014-12-04 22:28:02

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zoe回望

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2楼: Originally posted by 867575969 at 2014-12-04 23:11:00
分离胶浓度一般都是根据所跑蛋白大小确定的，一般全蛋白用14%即可，不知lz浓缩胶和分离胶跑的电压和时间分别是多少？看lz的图，貌似都没跑开！另外考染一般时间较长需过夜，分辨率没银染高，但考染背景较低，图像较 ...

浓缩胶的电压时80v，大约半小时到40分钟它就下去了，分离胶电压是120v，一直要跑到它到胶体下面，每次差不多有4个多小时的样子。就是，没跑开，不仅是我提的蛋白质，mark也没跑开。考染要过夜啊，哦哦，感谢。

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5楼2014-12-05 09:24:22

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867575969

至尊木虫 (著名写手)

One Piece

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分离胶浓度一般都是根据所跑蛋白大小确定的，一般全蛋白用14%即可，不知lz浓缩胶和分离胶跑的电压和时间分别是多少？看lz的图，貌似都没跑开！另外考染一般时间较长需过夜，分辨率没银染高，但考染背景较低，图像较清晰。

有些东西因为得不到而变得美好，有些东西因为拥有而变得弥足珍贵！

2楼2014-12-04 23:11:00

xiaoweiwei121

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换配方，换试剂吧
如果做了几块胶，都不出结果，基本就不用再做了，楼主用的配方和我用的有点差别，10%ap 用量就不一样
还有10%temed，我们直接用的temed，不知道你们是买来就是10%的还是其他。其他的也不太一样，
如果你想确认一下，是你的配方问题，还是你的试剂问题，不妨去你们临近的实验室做做看

3楼2014-12-05 06:42:31

zuozicong

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如果配胶和电泳试剂没问题的话，估计是样品处理的问题，样品是否残留强极性强电离的有机酸或离液剂，比如TCA或盐酸胍，以前遇到过。溴酚蓝跑着跑着就变黄了。不知道你的样品是怎么处理的？

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4楼2014-12-05 07:26:35

zoe回望

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3楼: Originally posted by xiaoweiwei121 at 2014-12-05 06:42:31
换配方，换试剂吧
如果做了几块胶，都不出结果，基本就不用再做了，楼主用的配方和我用的有点差别，10%ap 用量就不一样
还有10%temed，我们直接用的temed，不知道你们是买来就是10%的还是其他。其他的也不太一样， ...

temed是自己配的，买的是纯的。10%ap 我一般加的是两倍，因为那样的快些。我们实验室只有我老师喊我在做这个蛋白质，其他基本都是DNA，还有，我用自己的试剂是跑不出来，用之前师兄的试剂就是胶不凝（可能是试剂配的太久了，3月的，我估计是这个原因，）

6楼2014-12-05 09:28:49

zoe回望

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4楼: Originally posted by zuozicong at 2014-12-05 07:26:35
如果配胶和电泳试剂没问题的话，估计是样品处理的问题，样品是否残留强极性强电离的有机酸或离液剂，比如TCA或盐酸胍，以前遇到过。溴酚蓝跑着跑着就变黄了。不知道你的样品是怎么处理的？
...

样品有好几种处理方法，我把具体的贴出来你看看（这是我申请课题里面的，可能字有点多），不过确实有TCA这。
1、TCA-丙酮沉淀法
取一定量的土壤，加入4倍体积的预冷丙酮溶液，充分振荡摇匀后在-20℃冰箱中放置2h沉淀蛋白，然后4℃，12 000 r /min 离心30min。弃上清液，收集沉淀。加入2mL预冷的丙酮溶液，充分振荡混匀，- 20℃放置1h，清洗沉淀，4℃，12 000 r /min 离心15min。重复清洗3次。弃上清液，收集沉淀，然后置于-20℃冰箱中，使丙酮完全挥发。
2、酚-NaOH-醋酸铵-丙酮法
取5g土壤，加入10 mL 0.1mol /L的NaOH溶液，20℃振荡30min，之后在12000 r/min，20℃下离心10min，取6mL上清液，加入16mL液态酚和10mL去离水，20℃振荡60min，10000 r/min，20℃ 下离心10min，吸取15mL酚相，并加入15 mL去离子水，20℃振荡50min并离心，吸取15mL酚相并加入5倍体积的0.1 mol /L醋酸铵（用甲醇配置），-18℃过夜，后在12000 r/min，4℃下离心10min，获得的颗粒用0.1 mol /L醋酸铵洗涤，-18℃沉淀15min，之后离心，后用80%丙酮洗涤2次，然后置于-20℃冰箱中至丙酮挥发完全。
3、差速离心法（间接法）
取20g土壤样品，放入50ml离心管中，加入20ml冷的PBS缓冲液并放置在冰上，用混合式匀浆器匀浆30s,间隔后再处理30s，在2500g下低速离心5min，上清液收集在新的50ml的离心管。土壤沉淀重新加20ml冷的PBS液，同上操作步骤，合并两次的提取上清液，在4 ℃、10 000 ×g离心10min。离心后弃去上清，沉淀物中加入250ul冷的PBS ，涡旋后转移至2ml微量离心管中。在第一次的沉淀管中再加入250μL PBS，收集剩余的细胞残留物，收集合并2次的溶液。然后在10 000×g下离心10mn，收集沉淀并立即在液氮中冷冻。
4、直接裂解土壤/细胞提取宏蛋白质组学的方法
取5 g土壤放在50ml玻璃瓶，加入10ml碱性缓冲（5% SDS，50mM的Tris-HCl，pH值8.5；0.15 M NaCl；0.1mM EDTA； 1mM MgCl2；50mM DTT）。涡旋2-3分钟使其分散，然后沸水浴10min。将所得浆液冷却5分钟，然后转移到50ml Falcon管中，剧烈涡旋混合3min。将涡旋溶液离心（2095×g 10min），将上清液转移到新的管中。向每个试管中，加入冷冻100％三氯乙酸（TCA），并使终浓度为25 ％的TCA。颠倒试管几次，后将试管放置在-10℃条件下过夜。在20 800×g下离心20min，得到浓缩蛋白沉淀，弃去上清液。蛋白质沉淀用1ml冷丙酮（ -10℃ ）洗涤，然后离心（20 800 ×g，10min），丙酮洗涤步骤被重复三次。蛋白质沉淀在空气中干燥，直到所有的丙酮蒸发。

7楼2014-12-05 09:36:11

xiaoweiwei121

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6楼: Originally posted by zoe回望 at 2014-12-05 09:28:49
temed是自己配的，买的是纯的。10%ap 我一般加的是两倍，因为那样的快些。我们实验室只有我老师喊我在做这个蛋白质，其他基本都是DNA，还有，我用自己的试剂是跑不出来，用之前师兄的试剂就是胶不凝（可能是试剂配 ...

缓冲液和sds配好了放四度一年没什么问题，10%ap -20度一个月没问题。丙烯酰胺溶液用过4个月的没问题。胶不凝，一般就是ap 或者temed 的问题
你的胶上marker都看不到，是你没有放还是没跑出来。如果没跑出来，你的配方或者溶液就有大问题
曾经有一段时间撞墙期，胶怎么跑也不咋地。到最后换了sds，问题再也没出现过

8楼2014-12-05 13:31:41