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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 为什么酶切后什么都没有，连质粒都没有
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上帝的饮料

新虫 (初入文坛)

[求助] 为什么酶切后什么都没有，连质粒都没有 已有4人参与

构建了三个表达载体，用的是PET28a，DH5α转化，挑菌后摇了12个小时提质粒，质粒浓度都不是特别高，均在40左右。随后进行了双酶切验证，体系为10ul，酶切跑胶后什么条带都没有，应该不是DNA酶污染，别人也用了没问题。进行PCR验证是成功的，片段符合预期，求大神指导
第一个就是酶切的，最左边为Marker，后面的那个是PCR，条带正确

为什么酶切后什么都没有，连质粒都没有
Administrator 2015-07-24 22 时 28 分.jpg


为什么酶切后什么都没有，连质粒都没有-1
PCRYZCG 2015-07-25 11 时 10 分.png
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1楼 2015-07-27 15:00:44
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a86052

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
上帝的饮料: 金币+2, ★有帮助 2015-07-27 16:57:56
是不是质粒量太少了，不知道你一共切了多少ng的？第一个图片中marker最大条带是多大分子量，上面好像隐约有条带
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2楼2015-07-27 15:20:17
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上帝的饮料

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by a86052 at 2015-07-27 15:20:17
是不是质粒量太少了，不知道你一共切了多少ng的？第一个图片中marker最大条带是多大分子量，上面好像隐约有条带

质粒一共切400ng，maker最大条带是2000
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3楼2015-07-27 15:22:09
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 上帝的饮料 at 2015-07-27 15:22:09
质粒一共切400ng，maker最大条带是2000...

400ng应该足够了，你可以取点质粒直接跑胶看下，如果跑不出来，酶切也看不出来，既然能P出来还是应该有质粒的
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4楼2015-07-27 15:30:27
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上帝的饮料

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by a86052 at 2015-07-27 15:30:27
400ng应该足够了，你可以取点质粒直接跑胶看下，如果跑不出来，酶切也看不出来，既然能P出来还是应该有质粒的...

已经取过质粒直接跑胶了，依旧什么都没有
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5楼2015-07-27 15:41:39
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a86052

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 上帝的饮料 at 2015-07-27 15:41:39
已经取过质粒直接跑胶了，依旧什么都没有...

那么应该是浓度的问题了，浓度太低了，你这40可能测得不是那么准吧，不然跑胶应该能看得到的。。。不行把菌多摇些时间，摇的浓度高点，最后洗脱体积小些
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6楼2015-07-27 16:01:54
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xiaofeng521

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新提取吧，我用试剂盒提取，浓度都是400以上的，你的第二张图有带，太不亮。
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7楼2015-07-28 10:41:18
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tupokewang

铜虫 (小有名气)
质粒浓度问题，建立大量提取质粒，浓缩，提质粒可以用手提质粒，而不用试剂盒，另外手提质粒时菌体量要大。
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我相信我就是我，我相信明天。
8楼2015-07-28 10:57:06
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枭翔

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
40是用什么测的？nanodrop?
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9楼2015-07-28 14:02:29
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小小kiss

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我之前也遇到过这问题，后来发现是我用的酶过期了，导致酶切位点不单一，乱切，出不来条带，订了个新的酶问题就解决了

[ 发自小木虫客户端 ]
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10楼2015-07-28 22:57:56
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