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xiangqin90

新虫 (初入文坛)

[求助] pet28a小量表达 已有2人参与

小女子最近两个月在做蛋白表达，结果没有诱导现象，蛋白大小大约为72kD,之前用pet32a表达后蛋白大小在116KD处有点诱导现象，可是过Ni亲和柱，没有过到蛋白，蛋白不与柱子结合，之后又构建在pet28a载体上，可是用0.5mM IPTG诱导后菌长不起来，跑PAGE胶也没有诱导现象，什么原因，我现在该怎么解决这个问题？求助各位虫友，新手一枚，大家多多指点，谢谢！
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想要做的更好
1楼 2015-07-10 14:00:49
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2015-07-11 11:25:51
1.你的蛋白是融合蛋白吗？除了融合了组氨酸，还有其他的融合蛋白吗？
2.诱导时候菌长不起来：正确操作应该是先等菌长微浑浊之后再加iptg诱导；
3.长不起来的原因：你表达的蛋白有细胞毒性；iptg 诱导过猛，导致细胞集中能量表达目的蛋白了，但是细胞没几个，就没有目的条带。
4.镍柱质量可能有问题也说不定，你可以试一下其他带组氨酸标签的蛋白
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初来乍到，请多指教
2楼2015-07-10 23:02:18
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xiangqin90

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-07-10 23:02:18
1.你的蛋白是融合蛋白吗？除了融合了组氨酸，还有其他的融合蛋白吗？
2.诱导时候菌长不起来：正确操作应该是先等菌长微浑浊之后再加iptg诱导；
3.长不起来的原因：你表达的蛋白有细胞毒性；iptg 诱导过猛，导致细 ...

没有了，就一个基因直接重组在表达载体上。我一般是等菌长到OD值为0.6-0.8之间，才加IPTG的。用PET32A诱导时菌能够长出来，NI柱实验室的其他人用能过到蛋白，所以Ni柱应该是没有问题的。用pet28a载体IPTG的浓度降到0.1mM了，菌长到一定程度后不再长了，跑胶一点诱导现象都没有，请问还有什么解决方法没？我的基因在细胞内表达异常会诱发细胞凋亡，难道是我的蛋白有毒性？但是就算是有毒性不可能一点诱导现象也没有吧？
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想要做的更好
3楼2015-07-12 09:45:36
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顺利一生

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiangqin90 at 2015-07-12 09:45:36
没有了，就一个基因直接重组在表达载体上。我一般是等菌长到OD值为0.6-0.8之间，才加IPTG的。用PET32A诱导时菌能够长出来，NI柱实验室的其他人用能过到蛋白，所以Ni柱应该是没有问题的。用pet28a载体IPTG的浓度降到 ...

我也是等菌OD为0.6-0.8之间加iptg的 pet32a，转到BL21和rosseta 中，可是一直诱导不出来   换了各种温度  时间  iptg有1mm   就是诱导不明显   请问你的问题怎么解决的
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4楼2016-05-04 14:04:37
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