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xiangqin90

新虫 (初入文坛)

[求助] pet28a小量表达 已有2人参与

小女子最近两个月在做蛋白表达,结果没有诱导现象,蛋白大小大约为72kD,之前用pet32a表达后蛋白大小在116KD处有点诱导现象,可是过Ni亲和柱,没有过到蛋白,蛋白不与柱子结合,之后又构建在pet28a载体上,可是用0.5mM IPTG诱导后菌长不起来,跑PAGE胶也没有诱导现象,什么原因,我现在该怎么解决这个问题?求助各位虫友,新手一枚,大家多多指点,谢谢!
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香,分子生物期待您更多精彩。 2015-07-11 11:25:51
1.你的蛋白是融合蛋白吗?除了融合了组氨酸,还有其他的融合蛋白吗?
2.诱导时候菌长不起来:正确操作应该是先等菌长微浑浊之后再加iptg诱导;
3.长不起来的原因:你表达的蛋白有细胞毒性;iptg 诱导过猛,导致细胞集中能量表达目的蛋白了,但是细胞没几个,就没有目的条带。
4.镍柱质量可能有问题也说不定,你可以试一下其他带组氨酸标签的蛋白
初来乍到,请多指教
2楼2015-07-10 23:02:18
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xiangqin90

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ppppppppp at 2015-07-10 23:02:18
1.你的蛋白是融合蛋白吗?除了融合了组氨酸,还有其他的融合蛋白吗?
2.诱导时候菌长不起来:正确操作应该是先等菌长微浑浊之后再加iptg诱导;
3.长不起来的原因:你表达的蛋白有细胞毒性;iptg 诱导过猛,导致细 ...

没有了,就一个基因直接重组在表达载体上。我一般是等菌长到OD值为0.6-0.8之间,才加IPTG的。用PET32A诱导时菌能够长出来,NI柱实验室的其他人用能过到蛋白,所以Ni柱应该是没有问题的。用pet28a载体IPTG的浓度降到0.1mM了,菌长到一定程度后不再长了,跑胶一点诱导现象都没有,请问还有什么解决方法没?我的基因在细胞内表达异常会诱发细胞凋亡,难道是我的蛋白有毒性?但是就算是有毒性不可能一点诱导现象也没有吧?
想要做的更好
3楼2015-07-12 09:45:36
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顺利一生

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by xiangqin90 at 2015-07-12 09:45:36
没有了,就一个基因直接重组在表达载体上。我一般是等菌长到OD值为0.6-0.8之间,才加IPTG的。用PET32A诱导时菌能够长出来,NI柱实验室的其他人用能过到蛋白,所以Ni柱应该是没有问题的。用pet28a载体IPTG的浓度降到 ...

我也是等菌OD为0.6-0.8之间加iptg的 pet32a,转到BL21和rosseta 中,可是一直诱导不出来   换了各种温度  时间  iptg有1mm   就是诱导不明显   请问你的问题怎么解决的
4楼2016-05-04 14:04:37
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