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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 双抗夹心ELISA，怎么鉴定酶标抗体？
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ayiyaya

金虫 (小有名气)

[求助] 双抗夹心ELISA，怎么鉴定酶标抗体？

有一对配对抗体，把其中一个做了HRP标记，现在想确定HRP标记抗体的最佳工作浓度，但是目前还不知道最佳的包被抗体浓度，也不知道抗原要用多少浓度···
求指教，要如何下手？？？？？
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1楼 2015-07-09 14:18:51
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lima1988

铜虫 (小有名气)
做一系列抗体梯度包板（倍比稀释），再做酶标倍比稀释，分别交叉反应，终止读数即可
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奋斗是80后不变的话题
2楼2015-07-13 11:35:11
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普通回帖

ayiyaya

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lima1988 at 2015-07-13 11:35:11
做一系列抗体梯度包板（倍比稀释），再做酶标倍比稀释，分别交叉反应，终止读数即可

谢谢！！
可是怎么确定抗原浓度呢？？
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3楼2015-07-13 15:23:53
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lima1988

铜虫 (小有名气)
保证抗原过量就行了，你首先可以做了预实验，在抗体和酶标（比如都稀释个500倍做）都相同的条件下，抗原做了梯度，看到什么浓度的时候后面的OD值是稳定的就行了
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奋斗是80后不变的话题
4楼2015-07-14 10:58:28
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ayiyaya

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lima1988 at 2015-07-14 10:58:28
保证抗原过量就行了，你首先可以做了预实验，在抗体和酶标（比如都稀释个500倍做）都相同的条件下，抗原做了梯度，看到什么浓度的时候后面的OD值是稳定的就行了

知道了，非常感谢！！！！
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5楼2015-07-15 09:21:42
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ayiyaya

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lima1988 at 2015-07-14 10:58:28
保证抗原过量就行了，你首先可以做了预实验，在抗体和酶标（比如都稀释个500倍做）都相同的条件下，抗原做了梯度，看到什么浓度的时候后面的OD值是稳定的就行了

大神~
又出问题了，做双抗夹心的时候发现抗原吸附到酶标板上的现象非常严重，尝试了1%BSA和脱脂奶粉封闭，效果都差不多，抗原稀释液用过PBS+BSA和PBST+BSA，依然没有解决问题。我该肿么办？？？
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6楼2015-07-17 14:36:29
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6034

新虫 (初入文坛)
不知道楼主的问题解决了没有，自己也在做抗体配对，结果出现不加抗原的阴性孔也出现了明显的显色，值在0.8左右，这是不是说明抗体和酶标抗体直接反应了呢？不知道楼主有没有这方面的经验，还请赐教
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7楼2015-08-16 09:42:17
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ayiyaya

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 6034 at 2015-08-16 09:42:17
不知道楼主的问题解决了没有，自己也在做抗体配对，结果出现不加抗原的阴性孔也出现了明显的显色，值在0.8左右，这是不是说明抗体和酶标抗体直接反应了呢？不知道楼主有没有这方面的经验，还请赐教

我后来用PBST+BSA，37度封闭一个半小时，基本上解决了这个问题，你可以尝试一下不同的封闭条件。你的酶标抗体鉴定过没？本底怎么样？也有可能是酶标抗体标记问题。引起这种现象的原因很多，想办法验证，找到问题所在，再想办法解决就好了。
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8楼2015-08-17 16:07:13
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6034

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ayiyaya at 2015-08-17 16:07:13
我后来用PBST+BSA，37度封闭一个半小时，基本上解决了这个问题，你可以尝试一下不同的封闭条件。你的酶标抗体鉴定过没？本底怎么样？也有可能是酶标抗体标记问题。引起这种现象的原因很多，想办法验证，找到问题所 ...

你好，想问一下，你加这两样的比例是多少啊？我的酶标抗体用抗原鉴定了，也测定了它所用的稀释比例，本地挺低的，但是配对检测的时候，会出现明显的显色，今天做了对比，的确是不加抗原也能反应，哎，很无语，非常感谢你提供帮助，之前查的说有加Tween的，这两天尝试一下
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9楼2015-08-17 20:01:47
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6034

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by ayiyaya at 2015-08-17 16:07:13
我后来用PBST+BSA，37度封闭一个半小时，基本上解决了这个问题，你可以尝试一下不同的封闭条件。你的酶标抗体鉴定过没？本底怎么样？也有可能是酶标抗体标记问题。引起这种现象的原因很多，想办法验证，找到问题所 ...

请问PBST+BSA是用PBST做稀释液稀释BSA吗？
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10楼2015-08-17 20:48:49
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