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ayiyaya

金虫 (小有名气)

[求助] 双抗夹心ELISA,怎么鉴定酶标抗体?

有一对配对抗体,把其中一个做了HRP标记,现在想确定HRP标记抗体的最佳工作浓度,但是目前还不知道最佳的包被抗体浓度,也不知道抗原要用多少浓度···
求指教,要如何下手?????
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lima1988

铜虫 (小有名气)

做一系列抗体梯度包板(倍比稀释),再做酶标倍比稀释,分别交叉反应,终止读数即可
奋斗是80后不变的话题
2楼2015-07-13 11:35:11
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ayiyaya

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by lima1988 at 2015-07-13 11:35:11
做一系列抗体梯度包板(倍比稀释),再做酶标倍比稀释,分别交叉反应,终止读数即可

谢谢!!
可是怎么确定抗原浓度呢??
3楼2015-07-13 15:23:53
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lima1988

铜虫 (小有名气)

保证抗原过量就行了,你首先可以做了预实验,在抗体和酶标(比如都稀释个500倍做)都相同的条件下,抗原做了梯度,看到什么浓度的时候后面的OD值是稳定的就行了
奋斗是80后不变的话题
4楼2015-07-14 10:58:28
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ayiyaya

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lima1988 at 2015-07-14 10:58:28
保证抗原过量就行了,你首先可以做了预实验,在抗体和酶标(比如都稀释个500倍做)都相同的条件下,抗原做了梯度,看到什么浓度的时候后面的OD值是稳定的就行了

知道了,非常感谢!!!!
5楼2015-07-15 09:21:42
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ayiyaya

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lima1988 at 2015-07-14 10:58:28
保证抗原过量就行了,你首先可以做了预实验,在抗体和酶标(比如都稀释个500倍做)都相同的条件下,抗原做了梯度,看到什么浓度的时候后面的OD值是稳定的就行了

大神~
又出问题了,做双抗夹心的时候发现抗原吸附到酶标板上的现象非常严重,尝试了1%BSA和脱脂奶粉封闭,效果都差不多,抗原稀释液用过PBS+BSA和PBST+BSA,依然没有解决问题。我该肿么办???
6楼2015-07-17 14:36:29
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6034

新虫 (初入文坛)

不知道楼主的问题解决了没有,自己也在做抗体配对,结果出现不加抗原的阴性孔也出现了明显的显色,值在0.8左右,这是不是说明抗体和酶标抗体直接反应了呢?不知道楼主有没有这方面的经验,还请赐教
7楼2015-08-16 09:42:17
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ayiyaya

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 6034 at 2015-08-16 09:42:17
不知道楼主的问题解决了没有,自己也在做抗体配对,结果出现不加抗原的阴性孔也出现了明显的显色,值在0.8左右,这是不是说明抗体和酶标抗体直接反应了呢?不知道楼主有没有这方面的经验,还请赐教

我后来用PBST+BSA,37度封闭一个半小时,基本上解决了这个问题,你可以尝试一下不同的封闭条件。你的酶标抗体鉴定过没?本底怎么样?也有可能是酶标抗体标记问题。引起这种现象的原因很多,想办法验证,找到问题所在,再想办法解决就好了。
8楼2015-08-17 16:07:13
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6034

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ayiyaya at 2015-08-17 16:07:13
我后来用PBST+BSA,37度封闭一个半小时,基本上解决了这个问题,你可以尝试一下不同的封闭条件。你的酶标抗体鉴定过没?本底怎么样?也有可能是酶标抗体标记问题。引起这种现象的原因很多,想办法验证,找到问题所 ...

你好,想问一下,你加这两样的比例是多少啊?我的酶标抗体用抗原鉴定了,也测定了它所用的稀释比例,本地挺低的,但是配对检测的时候,会出现明显的显色,今天做了对比,的确是不加抗原也能反应,哎,很无语,非常感谢你提供帮助,之前查的说有加Tween的,这两天尝试一下
9楼2015-08-17 20:01:47
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6034

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by ayiyaya at 2015-08-17 16:07:13
我后来用PBST+BSA,37度封闭一个半小时,基本上解决了这个问题,你可以尝试一下不同的封闭条件。你的酶标抗体鉴定过没?本底怎么样?也有可能是酶标抗体标记问题。引起这种现象的原因很多,想办法验证,找到问题所 ...

请问PBST+BSA是用PBST做稀释液稀释BSA吗?
10楼2015-08-17 20:48:49
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