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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » 夹心ELISA，阴性值、空白值过高。
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蓝默儿

金虫 (小有名气)

[求助] 夹心ELISA，阴性值、空白值过高。 已有4人参与

一、酶标抗体是我自己的标记的，用原核表达的蛋白（1微克/ml）包被验证，同时设空白对照，酶标抗体稀释1：:10000时，OD值=1.0，
建夹心ELISA方法：1.用方阵法确定多抗和酶标抗体稀释浓度都为1:2000时，OD值=1.0左右
2.鼠源多抗包被（稀释度1:2000）；封闭液为5%脱脂乳封闭，37°，2h；抗原为纯化的蛋白（2微克/ml，），同时设阴性对照（胎牛血清），空白对照（PBS）；用标记的酶标抗体进行检测（稀释度1:2000），之后TMB显色，终止读数。阳性OD值=1.0左右，阴性OD值=0.8左右、空白OD值=0.8左右。
3，为什么阴性值，空白值那么高，难到酶标单抗与多抗反应了，不应该啊？鼠源多抗和鼠源单抗反应了？
4，感觉也不是封闭液的问题，板子不包被，直接封闭液为5%脱脂乳封闭，37°，2h，加酶标抗体进行检测，OD值=0.15以下。

之后我又用单抗包被，结果一样：阴性、空白值好高。
1.包被：将三种单抗混合，1：1000，1:2000,1:4000......1:128000稀释，做三个平行，4°过夜。
2.第二天洗涤4次，每次3min，拍干。5%脱脂乳封闭，37°，2h。
3.洗涤4次，每次3min，拍干。加抗原（为纯化好的原核表达蛋白）稀释浓度为2微克/ml，同时设阴性对照（胎牛血清1：100稀释），空白对照（PBS溶液)。37°，1h。
4.洗涤4次，每次3min，拍干。加酶标抗体（1:1000稀释），37°，1h。
5.洗涤4次，每次3min，拍干。加TMB显色，每孔100微升。37°，10min。
6.2M硫酸终止，
7.OD450读数。
结果，阳性值2.5，阴性对照和空白值很高可达到1.5。

之后我又用细胞上清包被，其他和上面一样，加酶标抗体（1:1000稀释），封闭用的是1%明胶和2%的BSA，2%的BSA封闭：阴性值1.8，阳性和空白值都在2.0以上。1%明胶封闭：阴性值1.0，阳性和空白值都在2.0以上
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微笑，自信，加油
1楼 2014-06-11 14:46:37
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
蓝默儿: 金币+2, ★有帮助 2014-06-11 17:54:06
从你的步骤来看似乎是酶标抗体与包被抗体反应了。你的包被抗体是三种单抗混合的，你试试分别用这三种单抗来包被，再做阴性对照和空白对照，如果只有一种包被的单抗最后检测的吸光值过高那就不用这种单抗包被。
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2楼2014-06-11 16:46:57
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蓝默儿

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 16:46:57
从你的步骤来看似乎是酶标抗体与包被抗体反应了。你的包被抗体是三种单抗混合的，你试试分别用这三种单抗来包被，再做阴性对照和空白对照，如果只有一种包被的单抗最后检测的吸光值过高那就不用这种单抗包被。

酶标抗体与包被抗体都是鼠源的，不应该反应啊，我试过用其中的一种单抗包被，阴性值和空白值是很高，我觉得是封闭液的问题，尝试了BSA和明胶还是一样。
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微笑，自信，加油
3楼2014-06-11 17:53:58
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wys476488620

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
是不是背景高了  你包被单抗试一试 吧
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踏踏实实的就行了
4楼2014-06-11 19:01:45
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逍潇

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 蓝默儿 at 2014-06-11 17:53:58
酶标抗体与包被抗体都是鼠源的，不应该反应啊，我试过用其中的一种单抗包被，阴性值和空白值是很高，我觉得是封闭液的问题，尝试了BSA和明胶还是一样。...

不包被直接封闭，背景值低，说明封闭没有任问题。都是鼠源的也不一定就不反应，我买的一种内参抗体beta-actin是鼠源的，同样可以检测小鼠beta-actin。既然你试过用其中的一种单抗包被，阴性值和空白值很高，那就把另外两种单抗也试一下看看，如果不高那问题就解决了。
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5楼2014-06-11 19:17:27
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采妮830

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加2抗没洗干净，不然不可能这么高
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6楼2014-06-12 14:14:54
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biotech_zhou

木虫 (著名写手)

待人以诚：专业/专注/专心

【答案】应助回帖

应该不是封闭的问题，洗的次数足够也不应该是没洗干净的问题，有可能是非特异性结合。
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年末优惠荧光定量pcr、WB、ELISA技术服务一律六折！交流锤炼知识，用心构筑桥梁，以更优质的产品及技术服务助力科研；QQ：2513165427；Email：b
7楼2014-07-01 18:23:55
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遍地花香

新虫 (初入文坛)
你找出原因来了吗'我也很想知道是什么原因
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8楼2015-05-13 19:42:52
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6034

新虫 (初入文坛)
嗯，也想问一下楼主找到原因没，最近在做双抗体夹心，酶标抗体也是自己标记的，两个抗体都是单抗，但是阴性（只加了稀释液）结果显色很明显，最高的能达到1.8左右，很是头疼，不知道什么原因。
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9楼2015-08-16 09:54:40
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