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蓝默儿

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[求助] 夹心ELISA，阴性值、空白值过高。已有4人参与

一、酶标抗体是我自己的标记的，用原核表达的蛋白（1微克/ml）包被验证，同时设空白对照，酶标抗体稀释1：:10000时，OD值=1.0，
建夹心ELISA方法：1.用方阵法确定多抗和酶标抗体稀释浓度都为1:2000时，OD值=1.0左右
2.鼠源多抗包被（稀释度1:2000）；封闭液为5%脱脂乳封闭，37°，2h；抗原为纯化的蛋白（2微克/ml，），同时设阴性对照（胎牛血清），空白对照（PBS）；用标记的酶标抗体进行检测（稀释度1:2000），之后TMB显色，终止读数。阳性OD值=1.0左右，阴性OD值=0.8左右、空白OD值=0.8左右。
3，为什么阴性值，空白值那么高，难到酶标单抗与多抗反应了，不应该啊？鼠源多抗和鼠源单抗反应了？
4，感觉也不是封闭液的问题，板子不包被，直接封闭液为5%脱脂乳封闭，37°，2h，加酶标抗体进行检测，OD值=0.15以下。

之后我又用单抗包被，结果一样：阴性、空白值好高。
1.包被：将三种单抗混合，1：1000，1:2000,1:4000......1:128000稀释，做三个平行，4°过夜。
2.第二天洗涤4次，每次3min，拍干。5%脱脂乳封闭，37°，2h。
3.洗涤4次，每次3min，拍干。加抗原（为纯化好的原核表达蛋白）稀释浓度为2微克/ml，同时设阴性对照（胎牛血清1：100稀释），空白对照（PBS溶液)。37°，1h。
4.洗涤4次，每次3min，拍干。加酶标抗体（1:1000稀释），37°，1h。
5.洗涤4次，每次3min，拍干。加TMB显色，每孔100微升。37°，10min。
6.2M硫酸终止，
7.OD450读数。
结果，阳性值2.5，阴性对照和空白值很高可达到1.5。

之后我又用细胞上清包被，其他和上面一样，加酶标抗体（1:1000稀释），封闭用的是1%明胶和2%的BSA，2%的BSA封闭：阴性值1.8，阳性和空白值都在2.0以上。1%明胶封闭：阴性值1.0，阳性和空白值都在2.0以上

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1楼 2014-06-11 14:46:37

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逍潇

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【答案】应助回帖

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蓝默儿: 金币+2, ★有帮助 2014-06-11 17:54:06

从你的步骤来看似乎是酶标抗体与包被抗体反应了。你的包被抗体是三种单抗混合的，你试试分别用这三种单抗来包被，再做阴性对照和空白对照，如果只有一种包被的单抗最后检测的吸光值过高那就不用这种单抗包被。

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2楼2014-06-11 16:46:57

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蓝默儿

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2楼: Originally posted by 逍潇 at 2014-06-11 16:46:57
从你的步骤来看似乎是酶标抗体与包被抗体反应了。你的包被抗体是三种单抗混合的，你试试分别用这三种单抗来包被，再做阴性对照和空白对照，如果只有一种包被的单抗最后检测的吸光值过高那就不用这种单抗包被。

酶标抗体与包被抗体都是鼠源的，不应该反应啊，我试过用其中的一种单抗包被，阴性值和空白值是很高，我觉得是封闭液的问题，尝试了BSA和明胶还是一样。

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3楼2014-06-11 17:53:58

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