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蓝默儿金虫 (小有名气)
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[求助]
夹心ELISA，阴性值、空白值过高。 已有4人参与
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一、酶标抗体是我自己的标记的，用原核表达的蛋白（1微克/ml）包被验证，同时设空白对照，酶标抗体稀释1：:10000时，OD值=1.0， 建夹心ELISA方法：1.用方阵法确定多抗和酶标抗体稀释浓度都为1:2000时，OD值=1.0左右 2.鼠源多抗包被（稀释度1:2000）；封闭液为5%脱脂乳封闭，37°，2h；抗原为纯化的蛋白（2微克/ml，），同时设阴性对照（胎牛血清），空白对照（PBS）；用标记的酶标抗体进行检测（稀释度1:2000），之后TMB显色，终止读数。阳性OD值=1.0左右，阴性OD值=0.8左右、空白OD值=0.8左右。 3，为什么阴性值，空白值那么高，难到酶标单抗与多抗反应了，不应该啊？鼠源多抗和鼠源单抗反应了？ 4，感觉也不是封闭液的问题，板子不包被，直接封闭液为5%脱脂乳封闭，37°，2h，加酶标抗体进行检测，OD值=0.15以下。 之后我又用单抗包被，结果一样：阴性、空白值好高。 1.包被：将三种单抗混合，1：1000，1:2000,1:4000......1:128000稀释，做三个平行，4°过夜。 2.第二天洗涤4次，每次3min，拍干。5%脱脂乳封闭，37°，2h。 3.洗涤4次，每次3min，拍干。加抗原（为纯化好的原核表达蛋白）稀释浓度为2微克/ml，同时设阴性对照（胎牛血清1：100稀释），空白对照（PBS溶液)。37°，1h。 4.洗涤4次，每次3min，拍干。加酶标抗体（1:1000稀释），37°，1h。 5.洗涤4次，每次3min，拍干。加TMB显色，每孔100微升。37°，10min。 6.2M硫酸终止， 7.OD450读数。 结果，阳性值2.5，阴性对照和空白值很高可达到1.5。 之后我又用细胞上清包被，其他和上面一样，加酶标抗体（1:1000稀释），封闭用的是1%明胶和2%的BSA，2%的BSA封闭：阴性值1.8，阳性和空白值都在2.0以上。1%明胶封闭：阴性值1.0，阳性和空白值都在2.0以上 |
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