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rola234新虫 (小有名气)
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PCR扩增没有结果，求教是引物Tm值相差太大，还是模板GC含量太高？ 已有8人参与
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| 这两天通过PCR扩增一个基因，基因本身比较长，大约1800bp左右，这个基因序列的GC含量为66%，总体上看还算正常，但当中有三四个区段的GC含量特别特别高，就是出现连续几十个甚至上百个GC碱基这样的序列，我设计的上游引物Tm之大约50.6℃，下游引物引物带入了一个NotI酶切位点，因此Tm值达到了66.8℃，两个引物的Tm值相差得有点大，今天试着做了一次PCR，但没有结果，我将退火温度从50℃到65℃做了一个梯度，但P了10管，都没有结果，非特异性扩增也几乎没有，只有最下面有一些引物二聚体。我确信我没有加错或者漏加东西，而且琼脂糖电泳也没有问题，就不太清楚到底是什么导致了PCR扩增没有结果，考虑来考虑去，觉得只有引物和模板的问题比较大，但不确定问题到底出在哪，求教小木虫上的各位高手了！ |
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rola234
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hl752268023
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7楼2015-07-02 16:55:51
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谢谢您的应助！今天把退火温度降到了45℃，果然是有条带了，但琼脂糖电泳的结果很奇怪，明明我的目的条带应该在1750bp左右，但却跑到了2000bp的位置，难道是我的marker不准？我也是醉了，打算明天再做一次。Tm值确实相差太大，这也是一个教训了，我打算将上游引物重新设计一下，在5'端引入一些没什么用的GC碱基，来平衡引物的Tm值。Not I 酶切位点我真是没办法，师兄之前就给我留的这个酶切位点，不用它构建就没办法做了。这个酶也不算太贵吧，NEB的快酶一支也不到300块，虽然量不多就是了。切割效率我个人觉得还是可以的，而且Not I 酶切位点长达8个碱基，特异性也高，我们实验室用得还挺多的！ |
8楼2015-07-02 17:25:13
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Jianxiao_H
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