应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增没有结果，求教是引物Tm值相差太大，还是模板GC含量太高？
161/2返回列表12下一页
查看: 9451  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

rola234

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增没有结果，求教是引物Tm值相差太大，还是模板GC含量太高？ 已有8人参与

这两天通过PCR扩增一个基因，基因本身比较长，大约1800bp左右，这个基因序列的GC含量为66%，总体上看还算正常，但当中有三四个区段的GC含量特别特别高，就是出现连续几十个甚至上百个GC碱基这样的序列，我设计的上游引物Tm之大约50.6℃，下游引物引物带入了一个NotI酶切位点，因此Tm值达到了66.8℃，两个引物的Tm值相差得有点大，今天试着做了一次PCR，但没有结果，我将退火温度从50℃到65℃做了一个梯度，但P了10管，都没有结果，非特异性扩增也几乎没有，只有最下面有一些引物二聚体。我确信我没有加错或者漏加东西，而且琼脂糖电泳也没有问题，就不太清楚到底是什么导致了PCR扩增没有结果，考虑来考虑去，觉得只有引物和模板的问题比较大，但不确定问题到底出在哪，求教小木虫上的各位高手了！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
我可以走得很慢，但我不会后退！
1楼 2015-07-01 21:44:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

rola234

新虫 (小有名气)
另外我的PCR体系是20微升的，95度预变性5min，每轮循环95度变性1min，退火按温度梯度进行1.5min，延伸2min，跑30个循环。
赞一下(1人) 回复此楼
我可以走得很慢，但我不会后退！
2楼2015-07-01 21:46:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rola234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 易水秋寒 at 2015-07-02 09:32:38
用的什么酶呢？

就是普通的热稳定taq酶，百斯凯公司买的，buffer也是配套的，72℃延伸
赞一下(1人) 回复此楼
我可以走得很慢，但我不会后退！
4楼2015-07-02 09:40:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hanyu426980

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先你两个引物退火温度相差太大了，最好不要超过5度，1800bp不算太长，如果GC含量高，可以尝试buffer选用高GC的，
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2015-07-02 10:34:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rola234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hanyu426980 at 2015-07-02 10:34:51
首先你两个引物退火温度相差太大了，最好不要超过5度，1800bp不算太长，如果GC含量高，可以尝试buffer选用高GC的，

引物设计的时候有考虑到这个问题，但师兄跟我说没事，PCR的条件总体还是很宽泛的，我也就没想那么多，随便PP应该有结果，但事与愿违。我现在在考虑将其中那个Tm值较低的引物的5'端引入一些没有意义的GC碱基，来平衡两个引物的Tm值
赞一下(1人) 回复此楼
我可以走得很慢，但我不会后退！
6楼2015-07-02 10:46:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hl752268023

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
上游引物 Tm值只有50  那么退火温度 应该更低一点才是吧 可能考虑45℃试试
另一方面  上下游引物 Tm值相差也太大了  不太好
还有 Not I 酶切位点 能不用就不用吧  这个酶又贵 又不是很好切开……
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2015-07-02 16:55:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

rola234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hl752268023 at 2015-07-02 16:55:51
上游引物 Tm值只有50  那么退火温度 应该更低一点才是吧 可能考虑45℃试试
另一方面  上下游引物 Tm值相差也太大了  不太好
还有 Not I 酶切位点 能不用就不用吧  这个酶又贵 又不是很好切开……

谢谢您的应助！今天把退火温度降到了45℃，果然是有条带了，但琼脂糖电泳的结果很奇怪，明明我的目的条带应该在1750bp左右，但却跑到了2000bp的位置，难道是我的marker不准？我也是醉了，打算明天再做一次。Tm值确实相差太大，这也是一个教训了，我打算将上游引物重新设计一下，在5'端引入一些没什么用的GC碱基，来平衡引物的Tm值。Not I 酶切位点我真是没办法，师兄之前就给我留的这个酶切位点，不用它构建就没办法做了。这个酶也不算太贵吧，NEB的快酶一支也不到300块，虽然量不多就是了。切割效率我个人觉得还是可以的，而且Not I 酶切位点长达8个碱基，特异性也高，我们实验室用得还挺多的！
赞一下(1人) 回复此楼
我可以走得很慢，但我不会后退！
8楼2015-07-02 17:25:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

易水秋寒

银虫 (初入文坛)
用的什么酶呢？
回复此楼
3楼2015-07-02 09:32:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Jianxiao_H

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
tm值只算与模板互补的碱基！
赞一下 回复此楼
多少辛酸不可告人。
9楼2015-07-03 12:31:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼上的正解，只算匹配的。p不出来就把退火温度降下来，条带多就把退火温度升上去。降的温度不要一下子5 度，慢慢降。可以做一个剃度

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
赞一下 回复此楼
初来乍到，请多指教
10楼2015-07-05 10:40:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 rola234 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +9 家与远方 2026-08-10 14/700 2026-08-13 09:41 by 臭臭不臭01
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +3 yuleib84 2026-08-11 3/150 2026-08-11 21:53 by jnhyjjm
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +8 Tide man 2026-08-10 9/450 2026-08-11 20:39 by beefly
[基金申请] 帮忙看看fileCode +7 wwncly 2026-08-10 13/650 2026-08-11 19:36 by 冰心玉壶晴
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 面上项目filecode邪修 +5 西山十月 2026-08-09 7/350 2026-08-10 07:32 by 仁砚薪传
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +5 布布和一二 2026-08-07 5/250 2026-08-09 16:15 by 袁向阳007
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode，很负责任的告诉大家 +6 爱看书的可乐 2026-08-08 7/350 2026-08-08 22:13 by a_niu
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 化学口download_prp&fileCode的固定段好像这几天一直没变，有变的大神么？ +3 Tide man 2026-08-07 4/200 2026-08-07 22:39 by Tide man
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭