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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR扩增没有结果，求教是引物Tm值相差太大，还是模板GC含量太高？
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rola234

新虫 (小有名气)

[求助] PCR扩增没有结果，求教是引物Tm值相差太大，还是模板GC含量太高？ 已有8人参与

这两天通过PCR扩增一个基因，基因本身比较长，大约1800bp左右，这个基因序列的GC含量为66%，总体上看还算正常，但当中有三四个区段的GC含量特别特别高，就是出现连续几十个甚至上百个GC碱基这样的序列，我设计的上游引物Tm之大约50.6℃，下游引物引物带入了一个NotI酶切位点，因此Tm值达到了66.8℃，两个引物的Tm值相差得有点大，今天试着做了一次PCR，但没有结果，我将退火温度从50℃到65℃做了一个梯度，但P了10管，都没有结果，非特异性扩增也几乎没有，只有最下面有一些引物二聚体。我确信我没有加错或者漏加东西，而且琼脂糖电泳也没有问题，就不太清楚到底是什么导致了PCR扩增没有结果，考虑来考虑去，觉得只有引物和模板的问题比较大，但不确定问题到底出在哪，求教小木虫上的各位高手了！
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我可以走得很慢，但我不会后退！
1楼 2015-07-01 21:44:11
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rola234

新虫 (小有名气)
另外我的PCR体系是20微升的，95度预变性5min，每轮循环95度变性1min，退火按温度梯度进行1.5min，延伸2min，跑30个循环。
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我可以走得很慢，但我不会后退！
2楼2015-07-01 21:46:13
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rola234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 易水秋寒 at 2015-07-02 09:32:38
用的什么酶呢？

就是普通的热稳定taq酶，百斯凯公司买的，buffer也是配套的，72℃延伸
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我可以走得很慢，但我不会后退！
4楼2015-07-02 09:40:29
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hanyu426980

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
首先你两个引物退火温度相差太大了，最好不要超过5度，1800bp不算太长，如果GC含量高，可以尝试buffer选用高GC的，
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5楼2015-07-02 10:34:51
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rola234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hanyu426980 at 2015-07-02 10:34:51
首先你两个引物退火温度相差太大了，最好不要超过5度，1800bp不算太长，如果GC含量高，可以尝试buffer选用高GC的，

引物设计的时候有考虑到这个问题，但师兄跟我说没事，PCR的条件总体还是很宽泛的，我也就没想那么多，随便PP应该有结果，但事与愿违。我现在在考虑将其中那个Tm值较低的引物的5'端引入一些没有意义的GC碱基，来平衡两个引物的Tm值
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我可以走得很慢，但我不会后退！
6楼2015-07-02 10:46:43
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hl752268023

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
上游引物 Tm值只有50  那么退火温度 应该更低一点才是吧 可能考虑45℃试试
另一方面  上下游引物 Tm值相差也太大了  不太好
还有 Not I 酶切位点 能不用就不用吧  这个酶又贵 又不是很好切开……
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7楼2015-07-02 16:55:51
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rola234

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by hl752268023 at 2015-07-02 16:55:51
上游引物 Tm值只有50  那么退火温度 应该更低一点才是吧 可能考虑45℃试试
另一方面  上下游引物 Tm值相差也太大了  不太好
还有 Not I 酶切位点 能不用就不用吧  这个酶又贵 又不是很好切开……

谢谢您的应助！今天把退火温度降到了45℃，果然是有条带了，但琼脂糖电泳的结果很奇怪，明明我的目的条带应该在1750bp左右，但却跑到了2000bp的位置，难道是我的marker不准？我也是醉了，打算明天再做一次。Tm值确实相差太大，这也是一个教训了，我打算将上游引物重新设计一下，在5'端引入一些没什么用的GC碱基，来平衡引物的Tm值。Not I 酶切位点我真是没办法，师兄之前就给我留的这个酶切位点，不用它构建就没办法做了。这个酶也不算太贵吧，NEB的快酶一支也不到300块，虽然量不多就是了。切割效率我个人觉得还是可以的，而且Not I 酶切位点长达8个碱基，特异性也高，我们实验室用得还挺多的！
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我可以走得很慢，但我不会后退！
8楼2015-07-02 17:25:13
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普通回帖

易水秋寒

银虫 (初入文坛)
用的什么酶呢？
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3楼2015-07-02 09:32:38
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Jianxiao_H

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
tm值只算与模板互补的碱基！
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多少辛酸不可告人。
9楼2015-07-03 12:31:21
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ppppppppp

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

楼上的正解，只算匹配的。p不出来就把退火温度降下来，条带多就把退火温度升上去。降的温度不要一下子5 度，慢慢降。可以做一个剃度

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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初来乍到，请多指教
10楼2015-07-05 10:40:13
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