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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » ppic9k转GS115筛选表达问题。
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Dearstar

新虫 (小有名气)

[求助] ppic9k转GS115筛选表达问题。 已有2人参与

各位虫友大家好，我现在在做一个很普通的实验，但是由于是第一次做毕赤酵母，所以找不出问题在哪里。求大家指导。
我把我的目的基因合成插入PPIC9K，（上海生工完成），测序报告目的序列正确，后期我自己又测序前端表达起始位点均无误，我将该质粒经过salI 酶切之后，电转入GS115中，然后涂布的MD平板（四个平板共长120个左右），后来，我从MD平板上挑取生长的菌落到G418低浓度YPD上培养，再逐渐升到高浓度，一直到8mg/ml，最后仍有十几个菌落，逐个挑取摇瓶发酵（按毕赤酵母操作手册），没有检测到目的蛋白，然后取其中一个上20L发酵罐，检测到了目的蛋白，但是其量只相当于之前单克隆的量，甚至更低些。同时，我验证了我的MD,YPD,G418平板，均没有问题。听说对G418抗性有积累，另外我把对应高浓度平板上的菌直接从MD转接到YPD平板上再挑取到8mg/ml也生长。
现在的问题的：如果是一个克隆的话，为什么可以8mg/mlG418上生长？如果是因为表达不好，克隆数和表达数不相对应的情况的话，再从转化开始那我这样的筛选方法是不是也是得不到我要的高拷贝呢？求大家不吝赐教，非常感谢。
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1楼 2015-06-03 08:39:08
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gongsiyi

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 人车 at 2015-08-24 10:48:20
你好 我也在做电转 我想问一下 质粒量需要用多少呢 我的电转之后一直都不长菌

一般质粒10-15微升，加到80微升GS115感受态中，做下一步电转。
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5楼2018-05-18 16:46:09
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人车

木虫 (正式写手)
你好 我也在做电转 我想问一下 质粒量需要用多少呢 我的电转之后一直都不长菌
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2楼2015-08-24 10:48:20
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高gaoeryang

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

有几个问题先问一下

1，你的片段插入在9K载体的位置？
2，你的菌浓高吗？
3，你用MD平板筛出转化子后其实可以挑几个用甲醇诱导培养看一下表达情况（将其作为初始菌，不同浓度G418筛得的多作为实验组）
4，另外，你也可以尝试一下多次电转筛选多拷贝

还有你的终极目标是多拷贝的话，你也可以这样做，洗脱后涂布，只要你G418梯度设置合理、宽泛，就一定能筛到最高拷贝的克隆，而挑单克隆毕竟不能将所有高拷贝转化子一网打尽，这是挑单克隆的弊端，往往很可能你会错过那些最高拷贝的克隆。

如果实验都没问题的话，表明你的表达量确实较低
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3楼2015-09-21 11:40:23
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halfbeer

捐助贵宾 (小有名气)

这是啥？

【答案】应助回帖

其实还有一个问题，并不是在高浓度G418上长的就一定比低浓度上的菌表达量高，手册虽然上没说，但是手册上说了Mut+和Muts的表达量的问题了，你可以都试试
赞一下 回复此楼
现在我们能做的就是努力努力再努力
4楼2015-09-21 15:00:33
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