| 查看: 2317 | 回复: 4 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
Dearstar新虫 (小有名气)
|
[求助]
ppic9k转GS115筛选表达问题。 已有2人参与
|
||
|
各位虫友大家好，我现在在做一个很普通的实验，但是由于是第一次做毕赤酵母，所以找不出问题在哪里。求大家指导。 我把我的目的基因合成插入PPIC9K，（上海生工完成），测序报告目的序列正确，后期我自己又测序前端表达起始位点均无误，我将该质粒经过salI 酶切之后，电转入GS115中，然后涂布的MD平板（四个平板共长120个左右），后来，我从MD平板上挑取生长的菌落到G418低浓度YPD上培养，再逐渐升到高浓度，一直到8mg/ml，最后仍有十几个菌落，逐个挑取摇瓶发酵（按毕赤酵母操作手册），没有检测到目的蛋白，然后取其中一个上20L发酵罐，检测到了目的蛋白，但是其量只相当于之前单克隆的量，甚至更低些。同时，我验证了我的MD,YPD,G418平板，均没有问题。听说对G418抗性有积累，另外我把对应高浓度平板上的菌直接从MD转接到YPD平板上再挑取到8mg/ml也生长。 现在的问题的：如果是一个克隆的话，为什么可以8mg/mlG418上生长？如果是因为表达不好，克隆数和表达数不相对应的情况的话，再从转化开始那我这样的筛选方法是不是也是得不到我要的高拷贝呢？求大家不吝赐教，非常感谢。 |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 蛋白表达纯化鉴定精华 |
» 猜你喜欢
面上意见出来了
已经有21人回复
-
能否申诉？
已经有8人回复
-
梦想
已经有5人回复
-
中青基了要发朋友圈吗？
已经有7人回复
-
有多少人是今天查系统知道结果的？
已经有19人回复
-
29号明天会评吗
已经有4人回复
-
国社科又开始会评了，不知道这次命运如何
已经有10人回复
-
基金不中，共勉
已经有12人回复
-
为什么到现在没收到通知？
已经有5人回复
-
有没有仍没收到信息的
已经有8人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 关于pPIC9K载体克隆表达基因的问题
已经有5人回复
- 有谁 对酵母体内基因如何过表达以及抑制基因使其下调懂啊，做过酵母的请进来，
已经有10人回复
- 毕赤酵母ppic9k表达原理问题
已经有7人回复
- 求助毕赤酵母转化问题
已经有11人回复
- smd1168毕赤酵母转化问题
已经有20人回复
- 毕赤酵母表达问题
已经有15人回复
- 毕赤酵母转化后遗传霉素筛选问题
已经有14人回复
- 关于毕赤酵母G418筛选
已经有9人回复
- 毕赤酵母电转化问题求助
已经有26人回复
- 毕赤酵母表达一直不表达
已经有13人回复
- 关于毕赤酵母gs115可否用转化化学转化
已经有6人回复
- 毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
已经有18人回复
- 毕赤酵母表达的蛋白无活性
已经有8人回复
- 【求助】微生物转化的问题
已经有8人回复
- 酵母转化的问题
已经有7人回复
- 毕赤酵母转化问题
已经有12人回复
- 【求助/交流】有人用过毕赤酵母GS115吗？
已经有15人回复
- 【求助/交流】关于毕赤酵母电转化
已经有22人回复
高gaoeryang
银虫 (小有名气)
- 应助: 18 (小学生)
- 金币: 324.2
- 散金: 300
- 红花: 3
- 帖子: 116
- 在线: 262.5小时
- 虫号: 2042656
- 注册: 2012-10-04
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
3楼2015-09-21 11:40:23
2楼2015-08-24 10:48:20
halfbeer
捐助贵宾 (小有名气)
这是啥？
- 应助: 32 (小学生)
- 金币: 2127.3
- 帖子: 285
- 在线: 115小时
- 虫号: 3453688
- 注册: 2014-10-03
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2015-09-21 15:00:33
5楼2018-05-18 16:46:09
10