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Dearstar新虫 (小有名气)
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[求助]
ppic9k转GS115筛选表达问题。已有2人参与
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各位虫友大家好，我现在在做一个很普通的实验，但是由于是第一次做毕赤酵母，所以找不出问题在哪里。求大家指导。 我把我的目的基因合成插入PPIC9K，（上海生工完成），测序报告目的序列正确，后期我自己又测序前端表达起始位点均无误，我将该质粒经过salI 酶切之后，电转入GS115中，然后涂布的MD平板（四个平板共长120个左右），后来，我从MD平板上挑取生长的菌落到G418低浓度YPD上培养，再逐渐升到高浓度，一直到8mg/ml，最后仍有十几个菌落，逐个挑取摇瓶发酵（按毕赤酵母操作手册），没有检测到目的蛋白，然后取其中一个上20L发酵罐，检测到了目的蛋白，但是其量只相当于之前单克隆的量，甚至更低些。同时，我验证了我的MD,YPD,G418平板，均没有问题。听说对G418抗性有积累，另外我把对应高浓度平板上的菌直接从MD转接到YPD平板上再挑取到8mg/ml也生长。 现在的问题的：如果是一个克隆的话，为什么可以8mg/mlG418上生长？如果是因为表达不好，克隆数和表达数不相对应的情况的话，再从转化开始那我这样的筛选方法是不是也是得不到我要的高拷贝呢？求大家不吝赐教，非常感谢。 |
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 蛋白表达纯化鉴定精华 |
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