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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物信息 » CODEHOP 结果怎么看以及简并引物设计相关问题
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308047410

新虫 (小有名气)

[求助] CODEHOP 结果怎么看以及简并引物设计相关问题已有2人参与

CODEHOP 结果怎么看？
下面是我用CODEHOP设计简并引物的结果，1、不知道怎么选择，A、B、C、D、中哪个是上游引物，哪个是下游引物？怎么知道简并引物之间的距离？引物的选择有什么要求？
另外2、在BLOCKMAKE 时输入的蛋白序列是全长?还是找到保守区域后的序列？
3、在CODEHOP阶段，没有本物种的密码子表，选择跟本物种不同目的物种可以吗？
4、筛选出引物之后还需要做哪些工作，需不需要验证引物？怎么验证？
求各位大师知道，感激不尽！
CODEHOP Results



Oligo Summary   Not all overlapping primers are shown

Warning: All weights in the block were less than or equal to zero.
Warning: Computing position-based sequence weights.

CODEHOP Version 10/14/04.1
COPYRIGHT 1997-2004, Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA, USA

Parameters:
Amino acids PSSM calculated with odds ratios normalized to 100
and back-translated with Standard genetic code
and codon usage table "../docs/shrimp.codon.use"
Maximum core degeneracy 128    Core strictness 0.00
Clamp strictness 1.00   Target clamp temperature 60.00 C
DNA Concentration 50.00 nM   Salt Concentration 50.00 mM
Codon boundary 0   Most common codon 0
Verbose 0   Output 3
Begin 1   PolyX 5
Suggested CODEHOPS: The degenerate region (core) is printed in lower case,
the non-degenerate region (clamp) is printed in upper case.

Block unknown__A
Oligos

W  G  R  P  E  D  M  T  M  D  R  P  S  W  K  I  D  S  E  A  P  G  T  D  L  A  A  E  T  A  A  A  L  A  A  A  S  I  V  F  Q  D  
                                                                     GACCTGGCCGCCgaracngcngc -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=72, len=12 temp= 61.6
                                                                GCACCGACCTGGCCgsngaracngc -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=76, len=14 temp= 63.7
                                                              CGGCACCGACCTGgcngsngarac -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=74, len=13 temp= 63.7
                         TGGACCGGCCCTGCkrbaarathga -3'  Core: degen=72 len=11  Clamp: score=65, len=14 temp= 61.5
  GGGCCGGCCCgarganatgac -3'  Core: degen=8 len=11  Clamp: score=71, len=10 temp= 62.6
TGGGGCCGGCCngarganatga -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=80, len=11 temp= 57.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
TGGGGCCGGccngarganatg -3'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=70, len=9 temp= 57.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
TGGGGCCGGccngarganat -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=70, len=9 temp= 57.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Complement of Block unknown__A
Oligos

W  G  R  P  E  D  M  T  M  D  R  P  S  W  K  I  D  S  E  A  P  G  T  D  L  A  A  E  T  A  A  A  L  A  A  A  S  I  V  F  Q  D  
         ggnctyctntaCTGGTACCTGGCCGG -5'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=78, len=15 temp= 62.8
          gnctyctntactGGTACCTGGCCGG -5'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=71, len=13 temp= 62.8
            ctyctntactgGTACCTGGCCGG -5'  Core: degen=8 len=11  Clamp: score=66, len=12 temp= 62.8
                                          ttytadctrhbGCTCCTGGGGCCGT -5'  Core: degen=108 len=11  Clamp: score=57, len=14 temp= 61.5
                                                                           cgncsnctytgGCGGCGGCGG -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=75, len=10 temp= 62.9
                                                                              csnctytgncgGCGGCGGGAC -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=73, len=10 temp= 60.6
                                                                                 ctytgncgncgGCGGGACCGGC -5'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=71, len=11 temp= 65.1

Block unknown__B
Oligos

W  Q  D  E  L  P  W  G  A  C  W  L  Y  R  A  T  G  E  E  S  Y  M  T  Q  A  Q  G  Y  I  E  E  F  G  F  
                            GCTGGCTGTACCGGgcnacnggnga -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=72, len=14 temp= 61.4
              GGCCTGGGGCGCCykntggytnta -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=74, len=13 temp= 63.7
             TGGCCTGGGGCgcnykntggyt -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=71, len=11 temp= 62.8
TGGsangaygaryt -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=66, len=3 temp=-100.4 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Complement of Block unknown__B
Oligos

W  Q  D  E  L  P  W  G  A  C  W  L  Y  R  A  T  G  E  E  S  Y  M  T  Q  A  Q  G  Y  I  E  E  F  G  F  
                  acccsncgnrmGACCGACATGGCCCGG -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=82, len=16 temp= 61.3
                        cgnrmnaccraCATGGCCCGGTGGC -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=73, len=14 temp= 61.1
                                          cgntgnccnctCCTCCGGATGAACTGGCT -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=61, len=18 temp= 61.7

Block unknown__C
Oligos

N  F  D  W  D  D  K  T  A  G  C  Y  A  L  M  A  E  L  D  
AACTTCGACtgggaygwnaa -3'  Core: degen=16 len=11  Clamp: score=77, len=9 temp= 43.3 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
AACTTCGAytgggaygwna -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=80, len=8 temp= 1.2 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
AACTTnkaytgggayg -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=82, len=5 temp=-50.5 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
AACktnkaytggga -3'  Core: degen=32 len=11  Clamp: score=77, len=3 temp=-118.0 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Complement of Block unknown__C
Oligos

N  F  D  W  D  D  K  T  A  G  C  Y  A  L  M  A  E  L  D  
    anmtraccctrcTGTTCTGGCGGCCGA -5'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=75, len=15 temp= 61.0
       traccctrcwntTCTGGCGGCCGACG -5'  Core: degen=32 len=12  Clamp: score=72, len=14 temp= 62.2
         accctrcwnttCTGGCGGCCGACG -5'  Core: degen=16 len=11  Clamp: score=68, len=13 temp= 62.2

Block unknown__D
Oligos

T  P  L  G  M  I  Y  I  M  D  W  G  S  L  R  H  A  M  N  V  A  F  I  A  A  R  A  A  S  L  G  I  D  T  E  E  Y  N  
                                            GCACGCCATGAACGTGgsnttyrtngc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=69, len=16 temp= 63.5

Complement of Block unknown__D
Oligos

T  P  L  G  M  I  Y  I  M  D  W  G  S  L  R  H  A  M  N  V  A  F  I  A  A  R  A  A  S  L  G  I  D  T  E  E  Y  N  
                                                            csnaaryancgGCAGGCCCGGC -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=56, len=11 temp= 64.9

Block unknown__E
Oligos

N  W  A  Q  T  Q  I  D  Y  A  L  G  S  T  G  H  S  Y  M  C  G  F  G  E  N  P  P  
                                                       TGTGCGGCTTCGGCrmnaayccncc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=80, len=14 temp= 60.2
                                                    ACATGTGCGGCTTCggnrmnaaycc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=80, len=14 temp= 60.4
                                             CACTCCTACATGTGCGGCttyggnrmnaa -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=74, len=18 temp= 61.3
                                     CCATGGGCCACTCCTACATGkknggnttygg -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=73, len=20 temp= 63.6
      GCCCAGACCCAGATCgaytayrcnbt -3'  Core: degen=96 len=11  Clamp: score=76, len=15 temp= 60.8
   TGGGCCCAGACCCAGryngaytayrc -3'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=78, len=15 temp= 60.1
  CTGGGCCCAGACCcarryngayta -3'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=73, len=13 temp= 60.1

Complement of Block unknown__E
Oligos

N  W  A  Q  T  Q  I  D  Y  A  L  G  S  T  G  H  S  Y  M  C  G  F  G  E  N  P  P  
               gtyyrnctratGCGGGACCCGAGGT -5'  Core: degen=64 len=11  Clamp: score=69, len=14 temp= 62.5
                     ctratrygnvaCCCGAGGTACCCGG -5'  Core: degen=96 len=11  Clamp: score=66, len=14 temp= 62.8
                                                            ccnaarccnykCTTGGGTGGT -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=78, len=10 temp= 27.1 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
                                                               aarccnyknttGGGTGGT -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=80, len=7 temp= 21.1 *** CLAMP NEEDS EXTENSION
                                                                  ccnyknttrggTGGT -5'  Core: degen=128 len=11  Clamp: score=66, len=4 temp=-14.8 *** CLAMP NEEDS EXTENSION

Block unknown__

X  M  K  A  W  I  D  M  P  M  L  V  P  F  D  F  Y  D  Q  E  Y  P  G  C  D  G  C  G  M  T  P  Y  D  Y  Y  Q  Y  S  
No suggested primers found.

Complement of Block unknown__

X  M  K  A  W  I  D  M  P  M  L  V  P  F  D  F  Y  D  Q  E  Y  P  G  C  D  G  C  G  M  T  P  Y  D  Y  Y  Q  Y  S  
No suggested primers found.
Oligos

Degenerate alphabet
Block unknown__A
         W  G  R  P  E  D  M
oligo:5'-TGGGGCCGGccngarganat-3' degen=32 temp=57.5   Extend clamp
         W  G  R  P  E  D  M  
oligo:5'-TGGGGCCGGccngarganatg-3' degen=32 temp=57.5   Extend clamp
         W  G  R  P  E  D  M  T
oligo:5'-TGGGGCCGGCCngarganatga-3' degen=32 temp=57.5   Extend clamp
          G  R  P  E  D  M  T
oligo:5'-GGGCCGGCCCgarganatgac-3' degen=8 temp=62.6
           D  R  P  S  W  K  I  D
oligo:5'-TGGACCGGCCCTGCkrbaarathga-3' degen=72 temp=61.5
          G  T  D  L  A  A  E  T
oligo:5'-CGGCACCGACCTGgcngsngarac-3' degen=64 temp=63.7
           T  D  L  A  A  E  T  A
oligo:5'-GCACCGACCTGGCCgsngaracngc-3' degen=64 temp=63.7
         D  L  A  A  E  T  A  A
oligo:5'-GACCTGGCCGCCgaracngcngc-3' degen=32 temp=61.6
Complement of Block unknown__A
P  E  D  M  T  M  D  R  P
ggnctyctntaCTGGTACCTGGCCGG oligo:5'-GGCCGGTCCATGGTCatntcytcngg-3' degen=32 temp=62.8
  E  D  M  T  M  D  R  P
gnctyctntactGGTACCTGGCCGG oligo:5'-GGCCGGTCCATGGtcatntcytcng-3' degen=32 temp=62.8
E  D  M  T  M  D  R  P
ctyctntactgGTACCTGGCCGG oligo:5'-GGCCGGTCCATGgtcatntcytc-3' degen=8 temp=62.8
K  I  D  S  E  A  P  G  T
ttytadctrhbGCTCCTGGGGCCGT oligo:5'-TGCCGGGGTCCTCGbhrtcdatytt-3' degen=108 temp=61.5
A  A  E  T  A  A  A  
cgncsnctytgGCGGCGGCGG oligo:5'-GGCGGCGGCGgtytcnscngc-3' degen=64 temp=62.9
A  E  T  A  A  A  L  
csnctytgncgGCGGCGGGAC oligo:5'-CAGGGCGGCGgcngtytcnsc-3' degen=64 temp=60.6
E  T  A  A  A  L  A  A
ctytgncgncgGCGGGACCGGC oligo:5'-CGGCCAGGGCGgcngcngtytc-3' degen=32 temp=65.1
Block unknown__B
         W  Q  D  E  L
oligo:5'-TGGsangaygaryt-3' degen=64 temp=-100.4   Extend clamp
           P  W  G  A  C  W  L
oligo:5'-TGGCCTGGGGCgcnykntggyt-3' degen=128 temp=62.8
          P  W  G  A  C  W  L  Y
oligo:5'-GGCCTGGGGCGCCykntggytnta-3' degen=128 temp=63.7
           W  L  Y  R  A  T  G  E
oligo:5'-GCTGGCTGTACCGGgcnacnggnga-3' degen=64 temp=61.4
Complement of Block unknown__B
W  G  A  C  W  L  Y  R  A  
acccsncgnrmGACCGACATGGCCCGG oligo:5'-GGCCCGGTACAGCCAGmrngcnsccca-3' degen=128 temp=61.3
A  C  W  L  Y  R  A  T  G
cgnrmnaccraCATGGCCCGGTGGC oligo:5'-CGGTGGCCCGGTACarccanmrngc-3' degen=128 temp=61.1
A  T  G  E  E  S  Y  M  T  Q
cgntgnccnctCCTCCGGATGAACTGGCT oligo:5'-TCGGTCAAGTAGGCCTCCtcnccngtngc-3' degen=64 temp=61.7
Block unknown__C
         N  F  D  W  D
oligo:5'-AACktnkaytggga-3' degen=32 temp=-118.0   Extend clamp
         N  F  D  W  D  D
oligo:5'-AACTTnkaytgggayg-3' degen=32 temp=-50.5   Extend clamp
         N  F  D  W  D  D  K
oligo:5'-AACTTCGAytgggaygwna-3' degen=32 temp=1.2   Extend clamp
         N  F  D  W  D  D  K
oligo:5'-AACTTCGACtgggaygwnaa-3' degen=16 temp=43.3   Extend clamp
Complement of Block unknown__C
  D  W  D  D  K  T  A  G  C
anmtraccctrcTGTTCTGGCGGCCGA oligo:5'-AGCCGGCGGTCTTGTcrtcccartmna-3' degen=32 temp=61.0
  W  D  D  K  T  A  G  C  
traccctrcwntTCTGGCGGCCGACG oligo:5'-GCAGCCGGCGGTCTtnwcrtcccart-3' degen=32 temp=62.2
W  D  D  K  T  A  G  C  
accctrcwnttCTGGCGGCCGACG oligo:5'-GCAGCCGGCGGTCttnwcrtccca-3' degen=16 temp=62.2
Block unknown__D
          H  A  M  N  V  A  F  I  A
oligo:5'-GCACGCCATGAACGTGgsnttyrtngc-3' degen=128 temp=63.5
Complement of Block unknown__D
A  F  I  A  A  R  A  A
csnaaryancgGCAGGCCCGGC oligo:5'-CGGCCCGGACGgcnayraansc-3' degen=128 temp=64.9
Block unknown__E
          W  A  Q  T  Q  I  D  Y
oligo:5'-CTGGGCCCAGACCcarryngayta-3' degen=64 temp=60.1
         W  A  Q  T  Q  I  D  Y  A
oligo:5'-TGGGCCCAGACCCAGryngaytayrc-3' degen=128 temp=60.1
         A  Q  T  Q  I  D  Y  A  L
oligo:5'-GCCCAGACCCAGATCgaytayrcnbt-3' degen=96 temp=60.8
           T  G  H  S  Y  M  C  G  F  G
oligo:5'-CCATGGGCCACTCCTACATGkknggnttygg-3' degen=128 temp=63.6
         H  S  Y  M  C  G  F  G  E  N
oligo:5'-CACTCCTACATGTGCGGCttyggnrmnaa-3' degen=128 temp=61.3
           M  C  G  F  G  E  N  P
oligo:5'-ACATGTGCGGCTTCggnrmnaaycc-3' degen=128 temp=60.4
           C  G  F  G  E  N  P  P
oligo:5'-TGTGCGGCTTCGGCrmnaayccncc-3' degen=128 temp=60.2
Complement of Block unknown__E
Q  I  D  Y  A  L  G  S  T
gtyyrnctratGCGGGACCCGAGGT oligo:5'-TGGAGCCCAGGGCGtartcnryytg-3' degen=64 temp=62.5
D  Y  A  L  G  S  T  G  H
ctratrygnvaCCCGAGGTACCCGG oligo:5'-GGCCCATGGAGCCCavngyrtartc-3' degen=96 temp=62.8
G  F  G  E  N  P  P  
ccnaarccnykCTTGGGTGGT oligo:5'-TGGTGGGTTCkynccraancc-3' degen=128 temp=27.1   Extend clamp
F  G  E  N  P  P  
aarccnyknttGGGTGGT oligo:5'-TGGTGGGttnkynccraa-3' degen=128 temp=21.1   Extend clamp
G  E  N  P  P  
ccnyknttrggTGGT oligo:5'-TGGTggrttnkyncc-3' degen=128 temp=-14.8   Extend clamp
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1楼2015-05-20 16:45:16
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

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308047410: 金币+15, ★★★很有帮助 2015-05-23 10:19:19
1.CODEHOP会根据每个block区同时设计上游引物及下游引物，你截图中Block unknown__A Oligos下方的5‘→3’的序列就是上游引物；再往下Complement of Block unknown__A Oligos下方的3‘→5’的序列就是下游引物。简并引物之间的距离可根据block区的位置信息估算，做完blockmake后，可看到每个block的位置信息。引物选择依据：上游引物在靠前的block中找，下游引物在靠后的block中找，引物间距离也就是产物大小不建议太长，因为简并引物PCR本身效率就较低，所以一般产物大小选择200-600bp（这是我的经验值，不一定对）。
2.做blockmake时，用的是全长蛋白质序列，这一步工作实际就是通过做多序列比对找到多序列间的保守区。
3.没有本物种密码子使用偏性表就使用亲缘关系近的，同科或同目或同纲。
4.筛出引物，最好的验证方法就是做PCR，实验结果是检验引物好坏的唯一标准。
赞一下(2人) 回复此楼
9楼2015-05-23 01:08:48
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308047410

新虫 (小有名气)
求回复！！！
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2楼2015-05-20 20:16:35
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308047410

新虫 (小有名气)
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3楼2015-05-21 09:51:05
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308047410

新虫 (小有名气)
请各位前辈给与指导，小妹在此拜谢
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4楼2015-05-21 15:58:31
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308047410

新虫 (小有名气)
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5楼2015-05-21 17:36:15
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tency

铁虫 (初入文坛)

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308047410: 金币+5 2015-05-21 21:48:19
1，先根据你比对的氨基酸位置确定引物上下游，根据一个氨基酸密码子对应3个碱基的关系，就可以确定上下游引物的距离。2，设计好的引物可以再oligo里评价一下，3，如果是几个蛋白质比对之后设引物的话，应该就是找保守区设引物，如果只是单纯找一个蛋白，想扩增背后的基因，可以找它的cds设计引物，4，引物验证的话，可以做PCR，然后产物割胶测序，看看。5，我也是新手，最近一直摸索，这是我的一些想法，有不对的地方请原谅。。
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6楼2015-05-21 17:54:00
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308047410

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by tency at 2015-05-21 17:54:00
1，先根据你比对的氨基酸位置确定引物上下游，根据一个氨基酸密码子对应3个碱基的关系，就可以确定上下游引物的距离。2，设计好的引物可以再oligo里评价一下，3，如果是几个蛋白质比对之后设引物的话，应该就是找保 ...

谢谢，我想请问primer5以及DNAMAN可以评价简并引物吗？
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7楼2015-05-21 21:48:02
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308047410

新虫 (小有名气)
希望懂的师兄师姐们能在给点指导意见！！！谢谢
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8楼2015-05-22 20:19:54
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308047410

新虫 (小有名气)
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9楼: Originally posted by stone2239 at 2015-05-23 01:08:48
1.CODEHOP会根据每个block区同时设计上游引物及下游引物，你截图中Block unknown__A Oligos下方的5‘→3’的序列就是上游引物；再往下Complement of Block unknown__A Oligos下方的3‘→5’的序列就是下游引物。简并 ...

还想问一下，如果选出来音舞之后要不要在软件上 评个分什么的 ？用什么软件 ？怎么评？谢谢 啦
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10楼2015-05-23 10:20:43
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