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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 引物设计后，看引物的特异性
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lanlvmaomao

新虫 (初入文坛)

[求助] 引物设计后，看引物的特异性 已有3人参与

本人菜鸟，刚刚学会设计引物。在验证引物特异性方面还有点疑问。这是我的一个引物的验证特异性的结果。求大家给看看特异性如何。
基因  NM_053056.2 Homo sapiens cyclin D1 (CCND1), mRNA
上游 CCCTCGGTGTCCTACTTCA
下游 CTCCTCGCACTTCTGTTCCT


MFEprimer2.0结果还不错。但是blast，有非特异的扩增，但是扩增片段蛮大的。求问战友，一般扩增多大的话可以忽略呢。要做好几种基因，有些基因的引物扩增还有几百bp的，这种是不是就不能忽略了呢。谢谢大家回答哈
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1楼 2014-04-11 20:28:02
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lanlvmaomao(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:10:06
lanlvmaomao: 金币+2 2014-04-16 11:06:07
软件分析、blast比对之类的东西都是很虚的，只能做参考。最好就是拿到引物后直接做个PCR，由实验结果分析引物的好坏。以前碰到过太多分析分数很高但是实际应用不好的引物，所以现在我都是一个primer 5把引物设计好就直接用了，都懒得分析。
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2楼2014-04-12 16:52:12
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Neo2000

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lanlvmaomao(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-04-12 17:10:17
lanlvmaomao: 金币+2 2014-04-16 11:06:14
从经验来看，primer-blast是个不错的选择，几乎百发百中

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3楼2014-04-12 17:01:17
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Echo_QIN

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2014-04-13 18:33:10
你好，我也最近做这方便的工作，想检验下我的primer产物，可是我放到NCBI的primer－blast中输进去forwad primer 和reverse primer ，出来的结果只有关于primer 的性质，根本没有预期产物，请问能帮我分析下吗，谢谢了
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4楼2014-04-13 13:39:45
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)
看不到
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5楼2014-04-14 16:25:24
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
blast只要出现你的目的基因就行了，实践验证又是另外一回事。
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学习使你立于不败之地
6楼2014-04-14 17:34:30
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yuren2009

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by Echo_QIN at 2014-04-13 13:39:45
你好，我也最近做这方便的工作，想检验下我的primer产物，可是我放到NCBI的primer－blast中输进去forwad primer 和reverse primer ，出来的结果只有关于primer 的性质，根本没有预期产物，请问能帮我分析下吗，谢谢 ...

你是不是放错位置了？也有可能基因库中还没有人传相关序列。
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学习使你立于不败之地
7楼2014-04-14 17:36:17
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hualidy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Echo_QIN at 2014-04-13 13:39:45
你好，我也最近做这方便的工作，想检验下我的primer产物，可是我放到NCBI的primer－blast中输进去forwad primer 和reverse primer ，出来的结果只有关于primer 的性质，根本没有预期产物，请问能帮我分析下吗，谢谢 ...

反向引物也是5‘-3’的顺序，遇到这种情况就是你把反向引物给弄反了，以前我也试过，你再试试！
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8楼2014-04-15 15:03:03
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葱花炒蛋

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hualidy at 2014-04-15 15:03:03
反向引物也是5‘-3’的顺序，遇到这种情况就是你把反向引物给弄反了，以前我也试过，你再试试！...

我也遇到同样的情况，我用primer5直接copy出来的引物序列，顺序是5‘-3’的，这个没错，但是也是只出现primer的性质，也是没预期产物的，你的问题现在解决了吗？我还不知道怎么去操作。
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9楼2015-07-27 09:10:33
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