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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 综合其他 » 大分子蛋白的原核表达
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zhangjie2005

木虫 (小有名气)

[求助] 大分子蛋白的原核表达 已有1人参与

本人初涉蛋白表达领域，要做的蛋白分子较大，有900个氨基酸，看文献中是先做一下蛋白可溶性分析和免疫原性分析，然后再做部分片段的原核表达。想请问一下应该怎么做这两种分析？用什么软件？跪谢！
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1楼 2015-05-20 10:06:12
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhangjie2005: 金币+5, ★有帮助 2015-05-20 17:33:34
蛋白的可溶性分析通常是用SDS-PAGE来做，具体操作如下：
诱导表达后，12000 rpm离心1 min收获菌体，50 mL菌液沉淀用5 mL结合缓冲液重悬，经超声波充分破碎后离心，沉淀重悬于1/10 体积的结合缓冲液中，分别取上清及沉淀进行电泳分析。取1.5ml诱导后的菌液，离心后将菌体重悬于100 ul Buffer A中，冰浴30分钟。离心收集菌体，上清即为周质蛋白部分，沉淀重悬于0.1mol/L Tris-HCl（PH8.0）溶液中，冻融破碎细胞，离心，上清为胞质部分，沉淀部分为不溶性包涵体和细胞膜组分。将各组分加入SDS-PAGE样品缓冲液，进行SDS-PAGE分析。
结合缓冲液: 0.5 mol/LNaCl，20 mmol/L Tris•Cl，2 mmol/L ZnCl2，5 mmol/L咪唑，PH7.5
Buffer A: 1mg/ml 溶菌酶、20% 蔗糖、30 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，PH8.0.
注意大分子蛋白表达时很容易降解

免疫原性检测可以用Western Blot来做
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早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
2楼2015-05-20 11:40:50
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zhangjie2005

木虫 (小有名气)
谢谢您的回复！我现在的问题是蛋白分子太大，不好做全长表达，所以想只表达其中一部分片段，这个选择要有个依据，该怎么选？有没有软件可以预测蛋白分子的可溶性和免疫原性，也就是说预测一下看抗原决定簇在哪部分？多谢！
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3楼2015-05-20 17:32:39
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恶魔的左眼

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangjie2005 at 2015-05-20 17:32:39
谢谢您的回复！我现在的问题是蛋白分子太大，不好做全长表达，所以想只表达其中一部分片段，这个选择要有个依据，该怎么选？有没有软件可以预测蛋白分子的可溶性和免疫原性，也就是说预测一下看抗原决定簇在哪部分？ ...

嗯，因为我主要从事的是蛋白表达的下游实验部分，所以对上游的分析做的比较少，我找同事问了一下，他们给我一个网址，你可以到上面对你的蛋白进行一下测试。祝你成功
http://mips.helmholtz-muenchen.de/proso/proso.seam
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zhangjie2005
早上一副睡不醒的样子，下午一副没睡醒的样子，晚上一副打了鸡血的样子！
4楼2015-05-21 09:18:31
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zhangjie2005

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 恶魔的左眼 at 2015-05-21 09:18:31
嗯，因为我主要从事的是蛋白表达的下游实验部分，所以对上游的分析做的比较少，我找同事问了一下，他们给我一个网址，你可以到上面对你的蛋白进行一下测试。祝你成功
http://mips.helmholtz-muenchen.de/proso/pr ...

这个网站很好，非常感谢！
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5楼2015-05-21 20:00:17
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