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zhangjie2005木虫 (小有名气)
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[求助]
大分子蛋白的原核表达 已有1人参与
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| 本人初涉蛋白表达领域，要做的蛋白分子较大，有900个氨基酸，看文献中是先做一下蛋白可溶性分析和免疫原性分析，然后再做部分片段的原核表达。想请问一下应该怎么做这两种分析？用什么软件？跪谢！ |
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 蛋白表达纯化与检测 |
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【答案】应助回帖
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蛋白的可溶性分析通常是用SDS-PAGE来做，具体操作如下： 诱导表达后，12000 rpm离心1 min收获菌体，50 mL菌液沉淀用5 mL结合缓冲液重悬，经超声波充分破碎后离心，沉淀重悬于1/10 体积的结合缓冲液中，分别取上清及沉淀进行电泳分析。取1.5ml诱导后的菌液，离心后将菌体重悬于100 ul Buffer A中，冰浴30分钟。离心收集菌体，上清即为周质蛋白部分，沉淀重悬于0.1mol/L Tris-HCl（PH8.0）溶液中，冻融破碎细胞，离心，上清为胞质部分，沉淀部分为不溶性包涵体和细胞膜组分。将各组分加入SDS-PAGE样品缓冲液，进行SDS-PAGE分析。 结合缓冲液: 0.5 mol/LNaCl，20 mmol/L Tris•Cl，2 mmol/L ZnCl2，5 mmol/L咪唑，PH7.5 Buffer A: 1mg/ml 溶菌酶、20% 蔗糖、30 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，PH8.0. 注意大分子蛋白表达时很容易降解 免疫原性检测可以用Western Blot来做 |
2楼2015-05-20 11:40:50
zhangjie2005
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嗯，因为我主要从事的是蛋白表达的下游实验部分，所以对上游的分析做的比较少，我找同事问了一下，他们给我一个网址，你可以到上面对你的蛋白进行一下测试。祝你成功 http://mips.helmholtz-muenchen.de/proso/proso.seam |
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zhangjie20054楼2015-05-21 09:18:31
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