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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » PCR就是P不出目的片段，急急急！
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ngd2013

新虫 (小有名气)

[求助] PCR就是P不出目的片段，急急急！ 已有4人参与

我的目的片段：GTGTCAGTCGAGACTAGGAAGATCA  CCAAGGTTCTTGTCGCTAACCGTGGTGAGATTGCAATCCGCGT…………TGTTCTCC  TCGAGATCAAGTAA（1776bp）。我的引物:上CCTACAATCTTTAGAGGAGACACAAC GTGTCAGTCGAGACTAGGAAGATCA，下TGCTCTAGA TTACTTGATCTCGA。
PCR条件1：95度30秒
2: 55度、58度，60度都试过，15秒
3:72度2分30秒
就是P不出目的片段，不知道到底哪里出错了，求救啊！！！
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1楼 2015-03-17 21:33:46
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gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你这引物也太长了吧。。。一般引物大小不是18-25bp么
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2楼2015-03-18 09:06:13
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gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

上游引物那是两种么？。。。一开始还以为是一条那么长。。。
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3楼2015-03-18 09:07:14
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ngd2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gnot_nail at 2015-03-18 09:07:14
上游引物那是两种么？。。。一开始还以为是一条那么长。。。

上游引物就是一条，我P出该片段，然后做重叠PCR的，这是下游片段
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4楼2015-03-18 09:09:53
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gnot_nail

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

一开始95度5min和最后的72度10min 有么？
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5楼2015-03-18 09:14:20
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ngd2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gnot_nail at 2015-03-18 09:14:20
一开始95度5min和最后的72度10min 有么？

有的
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6楼2015-03-18 09:30:54
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ngd2013: 金币+5, ★有帮助, 先感谢，我又学到了东西 2015-03-18 16:07:45
从对你的上下游引物分析的结果来看，理论上讲你这样的引物设计确实扩增不出目的条带。引物设计时正反向引物的Tm差别在5℃以内，与模板结合的上游引物的Tm为61℃，引物长度为25 bp;与模板结合的下游引物的Tm才39℃，长度为14 bp，所以你用55℃退火扩增不出来是正常的；建议你下游引物与模板结合的部分设计长一点，Tm在61℃左右。特别注意的是计算引物的退火温度时只能按照与模板互补那部分，不互补的是不能算进去的
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rainwater
7楼2015-03-18 11:19:17
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五维度的爱

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换一种PCR扩增的酶，看下你的片段是不是GC含量太高
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8楼2015-03-19 14:59:13
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谈笑之夜

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换个扩增效率强点的酶，这个片段还是比较长的。

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一天又一天
9楼2015-03-19 15:05:56
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