[交流] 大分子量蛋白WESTERN BLOT问题讨论与求助

请问，有没有人做过140-220KD的蛋白，大概条件是什么样的？需要注意什么？

我现在做140KD-220KD蛋白，一直做不出来，但是GAPDH还是可以出来。刚开始转膜不好，现在转膜后，GEL考染后基本都转到了膜上，但是目的蛋白依旧没条带，泳道曝光长了就全部糊掉，感觉有又是没有。

现在想问的问题是：1、β-巯基乙醇的浓度加错了，会不会造成蛋白分不开？比如38KD和42KD的就会连上？单独孵育两个抗体，相同的位置都有条带，一起孵育的话，条带加粗。

2、β-巯基乙醇的浓度会不会是造成泳道糊掉的原因？

3、在pcr仪中denature是不是不彻底？95° 6min
ps:一抗没问题，浓度也加大了。并且应该是有目的蛋白的。

求大神指点，万分的感谢！！！

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1楼 2015-01-30 14:36:57

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邻家小妹

新虫 (正式写手)

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专业: 细胞生物学研究中的新方法

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

你确定不是抗体不好，目的蛋白两百也不大；另外巯基乙醇只会影响二硫键，你的38KD和42KD哪来的二硫键连起来，如果你想分清楚，38KD和42KD ，建议电泳的时候，这个位置分得开一些，然后蛋白浓度稍微低一点儿不至于这两个条带重叠，同一张膜先用38 的抗体，扫完膜，然后回来退膜，再用42 的抗体，扫膜之后，再拿着两张片子来做比较

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