| 查看: 3120 | 回复: 5 | ||
avex514铁虫 (小有名气)
|
[求助]
P糖蛋白的western blot条件
|
|
因毕业在即，所以正抓紧时间完成毕业课题。其中需要用western blot分析对阿霉素耐药的MCF-7/ADR的P糖蛋白含量。采用碧云天的膜蛋白提取试剂盒对细胞提取膜蛋白，然后用5Xloading buffer对蛋白进行处理，按照公司提供的条件，70度水浴加热10min，上样量20微克，140V电泳，转膜液加了10%的甲醇，转膜条件是100V，90min，5%加了TBST脱脂牛奶封闭2h，一抗用的ABcam的ab80594，4度过夜，TBST清洗6次，每次5min，二抗室温孵育1h，TBST清洗6次，每次5min，显色，没有明显的条带，只是目的条带区域是一片黑色的（见下图1）。这个条件是公司推荐的条件，当然自己之前也试过很多条件，耗时4个月，沸水煮10min，上样量20微克，80V电泳，转膜条件用过很多，260mA 60或120min，100V 60，120或240min，300mA 60（下图2），90或120min等，结果都是如此。 请问各位大神，这是一抗的问题吗？ 现在考虑换抗体，abcam有两个抗体ab170903和ab170904都感觉可以，官网的说明上条带很明显，但是奇怪的是P糖蛋白的分子量是170 kda，但是abcam的抗体说明书上写的都是141kda，而官网上ab170903的条带出在250的位置上，ab170904的条带出在170的位置上，这个合理吗？ab170903能做流式，免疫组化和WB，ab170904只能做免疫组化和WB，但是ab170903只能识别人缘性的样品如细胞，但是ab170904除了适用于人缘性的样品外，还能适用于大鼠和小鼠来源的样品。二者链接分别如下： http://www.abcam.cn/p-glycoprotein-epr10363-antibody-ab170903.html http://www.abcam.cn/mdr1-epr10364-antibody-ab170904.html 麻烦大家帮我分析下问题，并且提下建议，该选择哪个抗体好点，在下已被折磨很久了，只求尽快解决问题！  图1.jpg  图2.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
申请环境，微生物方向博士
已经有3人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有4人回复
-
延安大学回应“副教授留绝笔信”：确已离世，正核实举报内容
已经有6人回复
-
售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
kx444555
至尊木虫 (正式写手)
- 应助: 56 (初中生)
- 贵宾: 1.326
- 金币: 10554.2
- 散金: 288
- 红花: 12
- 帖子: 820
- 在线: 238小时
- 虫号: 999718
- 注册: 2010-04-18
- 性别: GG
- 专业: 植物遗传学
【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
avex514: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-17 10:01:39
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-24 18:32:51
感谢参与，应助指数 +1
avex514: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-17 10:01:39
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-02-24 18:32:51
|
1.这个蛋白是糖基化蛋白，所以用ab80594做出的条带是正常的。可以适当调整一抗稀释度，条带会稍微干净些。 2.至于你说的170KD还是141KD的问题，这里我确信说是170KD的，ab170903和ab170904都是epitomics的产品，开发过程中band都在170KD左右，因为我们用的梯度胶，所以在 150－250KD间的比例和实际位置不会是那么精确， 3.ab80594不是epitomics的产品，所以不太清楚开发过程。，这两个产品都挺好，其中ab170904的QC结果WB结果不错，这个我更推荐一些，作为WB应用。 |
2楼2013-09-16 12:21:32
avex514
铁虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 5237.8
- 散金: 28
- 红花: 1
- 帖子: 267
- 在线: 25小时
- 虫号: 733636
- 注册: 2009-03-28
- 性别: GG
- 专业: 药理学
3楼2013-09-16 14:03:27
4楼2013-11-04 21:04:17
5楼2014-02-24 14:23:05
avex514
铁虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 5237.8
- 散金: 28
- 红花: 1
- 帖子: 267
- 在线: 25小时
- 虫号: 733636
- 注册: 2009-03-28
- 性别: GG
- 专业: 药理学
6楼2014-03-13 00:54:22
