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avex514铁虫 (小有名气)
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[求助]
P糖蛋白的western blot条件
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因毕业在即，所以正抓紧时间完成毕业课题。其中需要用western blot分析对阿霉素耐药的MCF-7/ADR的P糖蛋白含量。采用碧云天的膜蛋白提取试剂盒对细胞提取膜蛋白，然后用5Xloading buffer对蛋白进行处理，按照公司提供的条件，70度水浴加热10min，上样量20微克，140V电泳，转膜液加了10%的甲醇，转膜条件是100V，90min，5%加了TBST脱脂牛奶封闭2h，一抗用的ABcam的ab80594，4度过夜，TBST清洗6次，每次5min，二抗室温孵育1h，TBST清洗6次，每次5min，显色，没有明显的条带，只是目的条带区域是一片黑色的（见下图1）。这个条件是公司推荐的条件，当然自己之前也试过很多条件，耗时4个月，沸水煮10min，上样量20微克，80V电泳，转膜条件用过很多，260mA 60或120min，100V 60，120或240min，300mA 60（下图2），90或120min等，结果都是如此。 请问各位大神，这是一抗的问题吗？ 现在考虑换抗体，abcam有两个抗体ab170903和ab170904都感觉可以，官网的说明上条带很明显，但是奇怪的是P糖蛋白的分子量是170 kda，但是abcam的抗体说明书上写的都是141kda，而官网上ab170903的条带出在250的位置上，ab170904的条带出在170的位置上，这个合理吗？ab170903能做流式，免疫组化和WB，ab170904只能做免疫组化和WB，但是ab170903只能识别人缘性的样品如细胞，但是ab170904除了适用于人缘性的样品外，还能适用于大鼠和小鼠来源的样品。二者链接分别如下： http://www.abcam.cn/p-glycoprotein-epr10363-antibody-ab170903.html http://www.abcam.cn/mdr1-epr10364-antibody-ab170904.html 麻烦大家帮我分析下问题，并且提下建议，该选择哪个抗体好点，在下已被折磨很久了，只求尽快解决问题！  图1.jpg  图2.jpg |
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4楼2013-11-04 21:04:17
kx444555
至尊木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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1.这个蛋白是糖基化蛋白，所以用ab80594做出的条带是正常的。可以适当调整一抗稀释度，条带会稍微干净些。 2.至于你说的170KD还是141KD的问题，这里我确信说是170KD的，ab170903和ab170904都是epitomics的产品，开发过程中band都在170KD左右，因为我们用的梯度胶，所以在 150－250KD间的比例和实际位置不会是那么精确， 3.ab80594不是epitomics的产品，所以不太清楚开发过程。，这两个产品都挺好，其中ab170904的QC结果WB结果不错，这个我更推荐一些，作为WB应用。 |
2楼2013-09-16 12:21:32
avex514
铁虫 (小有名气)
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