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小妞116

铜虫 (小有名气)

[交流] 大分子量蛋白WESTERN BLOT问题讨论与求助

请问,有没有人做过140-220KD的蛋白,大概条件是什么样的?需要注意什么?

我现在做140KD-220KD蛋白,一直做不出来,但是GAPDH还是可以出来。刚开始转膜不好,现在转膜后,GEL考染后基本都转到了膜上,但是目的蛋白依旧没条带,泳道曝光长了就全部糊掉,感觉有又是没有。

现在想问的问题是:1、β-巯基乙醇的浓度加错了,会不会造成蛋白分不开?比如38KD和42KD的就会连上?单独孵育两个抗体,相同的位置都有条带,一起孵育的话,条带加粗。

                              2、β-巯基乙醇的浓度会不会是造成泳道糊掉的原因?

                             3、在pcr仪中denature是不是不彻底?95° 6min
ps:一抗没问题,浓度也加大了。并且应该是有目的蛋白的。

求大神指点,万分的感谢!!!
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邻家小妹

新虫 (正式写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你确定不是抗体不好,目的蛋白两百也不大;另外巯基乙醇只会影响二硫键,你的38KD和42KD哪来的二硫键连起来,如果你想分清楚,38KD和42KD ,建议电泳的时候 ,这个位置分得开一些,然后蛋白浓度稍微低一点儿 不至于这两个条带重叠,同一张膜先用38 的抗体 ,扫完膜,然后回来退膜 ,再用42 的抗体,扫膜之后,再拿着两张片子来做比较
2楼2016-05-27 13:02:28
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