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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 做菌p时空载也能跑出目的条带
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木欣欣60

新虫 (小有名气)

[求助] 做菌p时空载也能跑出目的条带 已有6人参与

现已将目的基因与表达载体连接转化，但是挑菌时做菌p用空的表达载体质粒去跑PCR，结果发现和目的片段有同样的大小，导致菌P都无法筛出阳性克隆，结果拿去测序，全是失败。有哪位大神能帮我分析下吗？空的表达载体pcr能p出目的基因的大小片段，这种情况正常不？
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顺顺利利做实验，高高兴兴搞科研，幸幸福福地毕业。
1楼 2015-01-27 16:23:36
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

logowang

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:34
一，注意你使用的引物，可能存在引物使用不当，比如在你的情况下colony pcr应选择载体特异上游引物+基因特异下游引物（或者颠倒），这样回避免直接使用一对载体特异引物所造成的影响。

二，检查你的载体来源，由于pbi121是比较传统的载体了，可能会导致你的载体来源不明，或者几经周折里面已经有不明确的插入片段了，这种情况下加上引物的使用不当，可能会造成你所描述的现象。

三，对于测序测不出，有可能是你挑选的“所谓” 阳性克隆并不包含目的plasmid， 不知道你是否是使用plasmid 测序，还是直接给菌让公司测序，如果你能正常提取plasmid的话，那么使用m13引物一般不会出现无结果的情况，除非公司技术人员不熟练。推测菌体里并没有你的目的plasmid。

总合，最大的可能是你在做连接转化的时候已经失败， 所产生的阳性菌落均是杂菌，
而杂菌在菌pcr检测的时候，如果退火温度过低，也可以形成弱弱的一条带（如果你描述的pcr只是弱弱的条带，那么很大可能是杂带）这样就给你阳性菌和阴性对照菌都扩增出东西的错觉。

建议，可以尝试提你的菌的plasmid，如果无法提出，那么杂菌无疑，这样直接重新连接转化，并且一定要确认好你的载体来源，别忙活半天，到头来载体出错，一切白费。
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6楼2015-01-27 21:38:09
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普通回帖

stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:17
菌P时建议用载体的通用引物P，另外，P时加阴性、阳性对照
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2楼2015-01-27 16:51:13
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:26
你的基因多长啊，是不是和载体一样长度？用M13鉴定吧！很给力！
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
3楼2015-01-27 20:43:27
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木欣欣60

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2015-01-27 20:43:27
你的基因多长啊，是不是和载体一样长度？用M13鉴定吧！很给力！

不是，我的基因才500bp左右，所用载体为植物过表达载体pbi121，我把之间比对过，也没多少重复的序列啊，我就不知道是怎么回事了，导致我自己菌p做了也没用，太多的假阳性存在了。
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4楼2015-01-27 21:08:17
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人
引用回帖:
4楼: Originally posted by 木欣欣60 at 2015-01-27 21:08:17
不是，我的基因才500bp左右，所用载体为植物过表达载体pbi121，我把之间比对过，也没多少重复的序列啊，我就不知道是怎么回事了，导致我自己菌p做了也没用，太多的假阳性存在了。...

板中加入IPTGX-AL了吗
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
5楼2015-01-27 21:20:01
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木欣欣60

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by logowang at 2015-01-27 21:38:09
一，注意你使用的引物，可能存在引物使用不当，比如在你的情况下colony pcr应选择载体特异上游引物+基因特异下游引物（或者颠倒），这样回避免直接使用一对载体特异引物所造成的影响。

二，检查你的载体来源，由 ...

嗯，前辈说的对，1.我现在正把我的载体质粒送去测序，测35s启动子到我需要的酶切位点之间的片段。确保载体无错。2.我之前也用载体的35s启动子和我的目的条带下游引物做的菌p，我以为是自己把两者的退火温度没选好所以没扩出条带来。然后就还是用的自己的目的基因的上下游去菌p。3.我在菌p时都会选择较亮条带送去测序，弱弱的条带我就把它认为杂菌了。4.现在是越来越奇怪了，我之前涂200u的菌液都长了很多，过了几天再涂什么都没长，唉。。。前辈。
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7楼2015-01-28 10:06:20
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木欣欣60

新虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2015-01-27 21:20:01
板中加入IPTGX-AL了吗...

这是？我们实验室就按普通的LB加KAN配方进行配置培养板。我用同样的恢复液200u去涂，第一次长了很多，但测序都失败。第二次涂200u，一个都没长。真是痛苦啊~~~
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顺顺利利做实验，高高兴兴搞科研，幸幸福福地毕业。
8楼2015-01-28 10:08:47
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titus0805

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
提了质粒再p吧，可能菌株基因组里有扩增
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9楼2015-01-28 10:44:11
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人
引用回帖:
8楼: Originally posted by 木欣欣60 at 2015-01-28 10:08:47
这是？我们实验室就按普通的LB加KAN配方进行配置培养板。我用同样的恢复液200u去涂，第一次长了很多，但测序都失败。第二次涂200u，一个都没长。真是痛苦啊~~~...

200ul要是少就多涂一点，试一试
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
10楼2015-01-28 11:29:32
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