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木欣欣60

新虫 (小有名气)

[求助] 做菌p时空载也能跑出目的条带 已有6人参与

现已将目的基因与表达载体连接转化，但是挑菌时做菌p用空的表达载体质粒去跑PCR，结果发现和目的片段有同样的大小，导致菌P都无法筛出阳性克隆，结果拿去测序，全是失败。有哪位大神能帮我分析下吗？空的表达载体pcr能p出目的基因的大小片段，这种情况正常不？
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顺顺利利做实验，高高兴兴搞科研，幸幸福福地毕业。
1楼 2015-01-27 16:23:36
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木欣欣60

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by logowang at 2015-01-27 21:38:09
一，注意你使用的引物，可能存在引物使用不当，比如在你的情况下colony pcr应选择载体特异上游引物+基因特异下游引物（或者颠倒），这样回避免直接使用一对载体特异引物所造成的影响。

二，检查你的载体来源，由 ...

嗯，前辈说的对，1.我现在正把我的载体质粒送去测序，测35s启动子到我需要的酶切位点之间的片段。确保载体无错。2.我之前也用载体的35s启动子和我的目的条带下游引物做的菌p，我以为是自己把两者的退火温度没选好所以没扩出条带来。然后就还是用的自己的目的基因的上下游去菌p。3.我在菌p时都会选择较亮条带送去测序，弱弱的条带我就把它认为杂菌了。4.现在是越来越奇怪了，我之前涂200u的菌液都长了很多，过了几天再涂什么都没长，唉。。。前辈。
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顺顺利利做实验，高高兴兴搞科研，幸幸福福地毕业。
7楼2015-01-28 10:06:20
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:17
菌P时建议用载体的通用引物P，另外，P时加阴性、阳性对照
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2楼2015-01-27 16:51:13
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飞约疯人院

专家顾问 (著名写手)

科学怪人

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:26
你的基因多长啊，是不是和载体一样长度？用M13鉴定吧！很给力！
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人生贵在行动，迟疑不决时，不妨先迈出小小一步。
3楼2015-01-27 20:43:27
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木欣欣60

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 飞约疯人院 at 2015-01-27 20:43:27
你的基因多长啊，是不是和载体一样长度？用M13鉴定吧！很给力！

不是，我的基因才500bp左右，所用载体为植物过表达载体pbi121，我把之间比对过，也没多少重复的序列啊，我就不知道是怎么回事了，导致我自己菌p做了也没用，太多的假阳性存在了。
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顺顺利利做实验，高高兴兴搞科研，幸幸福福地毕业。
4楼2015-01-27 21:08:17
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