| 查看: 6586 | 回复: 13 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
木欣欣60新虫 (小有名气)
|
[求助]
做菌p时空载也能跑出目的条带 已有6人参与
|
||
| 现已将目的基因与表达载体连接转化，但是挑菌时做菌p用空的表达载体质粒去跑PCR，结果发现和目的片段有同样的大小，导致菌P都无法筛出阳性克隆，结果拿去测序，全是失败。有哪位大神能帮我分析下吗？空的表达载体pcr能p出目的基因的大小片段，这种情况正常不？ |
回复此楼» 猜你喜欢
氢氧化钾活化操作
已经有19人回复
-
散金
已经有68人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有123人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
-
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析
已经有0人回复
-
AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点
已经有0人回复
-
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 菌液pcr,坐等求助
已经有20人回复
- PCR时不加模板的对照中跑出了与目的片段大小相近的条带怎么回事？
已经有11人回复
- 菌落PCR有目的条带，重组质粒提取PCR却没条带，请问是什么原因？
已经有13人回复
- 关于构载体过程中PCR验证正确但是测序为空载体的困惑
已经有7人回复
- 蓝白斑筛选白色菌落PCR无条带
已经有12人回复
- 未插入目的片段的空载体质粒怎么扩增出目的条带，求解，求真相！！！！
已经有4人回复
- 求助关于双酶切空载跑胶没有条带！
已经有15人回复
- RT-PCR时GAPDH能跑出来，但目的条带跑不出来~~
已经有7人回复
- PCR目的条带没跑出，但是跑出了特异性很强的单一条带，是什么原因呢？
已经有9人回复
- 【求助/交流】分子克隆
已经有15人回复
- 【求助/交流】为什么我的PCR产物总是连接不上T载体
已经有26人回复
【答案】应助回帖
★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:34
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:34
|
一，注意你使用的引物，可能存在引物使用不当，比如在你的情况下colony pcr应选择载体特异上游引物+基因特异下游引物（或者颠倒），这样回避免直接使用一对载体特异引物所造成的影响。 二，检查你的载体来源，由于pbi121是比较传统的载体了，可能会导致你的载体来源不明，或者几经周折里面已经有不明确的插入片段了，这种情况下加上引物的使用不当，可能会造成你所描述的现象。 三，对于测序测不出，有可能是你挑选的“所谓” 阳性克隆并不包含目的plasmid， 不知道你是否是使用plasmid 测序，还是直接给菌让公司测序，如果你能正常提取plasmid的话，那么使用m13引物一般不会出现无结果的情况，除非公司技术人员不熟练。推测菌体里并没有你的目的plasmid。 总合，最大的可能是你在做连接转化的时候已经失败， 所产生的阳性菌落均是杂菌， 而杂菌在菌pcr检测的时候，如果退火温度过低，也可以形成弱弱的一条带（如果你描述的pcr只是弱弱的条带，那么很大可能是杂带）这样就给你阳性菌和阴性对照菌都扩增出东西的错觉。 建议，可以尝试提你的菌的plasmid，如果无法提出，那么杂菌无疑，这样直接重新连接转化，并且一定要确认好你的载体来源，别忙活半天，到头来载体出错，一切白费。 |
6楼2015-01-27 21:38:09
2楼2015-01-27 16:51:13
飞约疯人院
专家顾问 (著名写手)
科学怪人
-
专家经验: +140 - MolEPI: 2
- 应助: 308 (大学生)
- 金币: 1107.5
- 散金: 8294
- 红花: 65
- 沙发: 5
- 帖子: 1996
- 在线: 266.1小时
- 虫号: 3188421
- 注册: 2014-05-07
- 专业: 生物化学
- 管辖: 分子生物
3楼2015-01-27 20:43:27
木欣欣60
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 160.4
- 散金: 4
- 帖子: 55
- 在线: 27.9小时
- 虫号: 3095908
- 注册: 2014-03-28
- 性别: MM
- 专业: 蔬菜学与瓜果学
4楼2015-01-27 21:08:17
