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木欣欣60新虫 (小有名气)
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[求助]
做菌p时空载也能跑出目的条带 已有6人参与
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| 现已将目的基因与表达载体连接转化，但是挑菌时做菌p用空的表达载体质粒去跑PCR，结果发现和目的片段有同样的大小，导致菌P都无法筛出阳性克隆，结果拿去测序，全是失败。有哪位大神能帮我分析下吗？空的表达载体pcr能p出目的基因的大小片段，这种情况正常不？ |
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:34
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-27 21:49:34
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一，注意你使用的引物，可能存在引物使用不当，比如在你的情况下colony pcr应选择载体特异上游引物+基因特异下游引物（或者颠倒），这样回避免直接使用一对载体特异引物所造成的影响。 二，检查你的载体来源，由于pbi121是比较传统的载体了，可能会导致你的载体来源不明，或者几经周折里面已经有不明确的插入片段了，这种情况下加上引物的使用不当，可能会造成你所描述的现象。 三，对于测序测不出，有可能是你挑选的“所谓” 阳性克隆并不包含目的plasmid， 不知道你是否是使用plasmid 测序，还是直接给菌让公司测序，如果你能正常提取plasmid的话，那么使用m13引物一般不会出现无结果的情况，除非公司技术人员不熟练。推测菌体里并没有你的目的plasmid。 总合，最大的可能是你在做连接转化的时候已经失败， 所产生的阳性菌落均是杂菌， 而杂菌在菌pcr检测的时候，如果退火温度过低，也可以形成弱弱的一条带（如果你描述的pcr只是弱弱的条带，那么很大可能是杂带）这样就给你阳性菌和阴性对照菌都扩增出东西的错觉。 建议，可以尝试提你的菌的plasmid，如果无法提出，那么杂菌无疑，这样直接重新连接转化，并且一定要确认好你的载体来源，别忙活半天，到头来载体出错，一切白费。 |
6楼2015-01-27 21:38:09
11楼2015-01-28 18:56:00